郭建國(guó), 趙龍浩, 徐 丹, 孫野青

大連海事大學(xué)環(huán)境系統(tǒng)生物學(xué)研究所, 大連 116026

洪水對(duì)大凌河河流浮游細(xì)菌群落的影響

郭建國(guó), 趙龍浩, 徐 丹, 孫野青*

大連海事大學(xué)環(huán)境系統(tǒng)生物學(xué)研究所, 大連 116026

洪水是一種突發(fā)性強(qiáng)、破壞力大的自然災(zāi)害，它不僅造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且對(duì)生態(tài)環(huán)境也有嚴(yán)重危害。在地球生物化學(xué)過(guò)程中起重要作用的微生物是否也受到影響值得深入研究。2012年采集了洪水暴發(fā)前后遼寧省錦州段大凌河表層水樣，利用DGGE技術(shù)，結(jié)合PCA和RDA分析研究了洪水對(duì)河流表層水中細(xì)菌群落的影響。結(jié)果表明：(1)洪水發(fā)生前后河流表層水中的細(xì)菌群落發(fā)生了改變:洪水發(fā)生前河流中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與河段所處的自然環(huán)境有很大的相關(guān)性，而洪水發(fā)生后這一現(xiàn)象消失。(2)洪水發(fā)生前，影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因素是pH和鹽度，而洪水發(fā)生后，影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因素是總磷。這一研究結(jié)果提示洪水通過(guò)改變河流表層水環(huán)境特性對(duì)其中的細(xì)菌群落進(jìn)行重塑。

細(xì)菌群落; 洪水; DGGE; 表層水

洪水是由于氣候的原因?qū)е戮植康貐^(qū)大雨、暴雨或大范圍較長(zhǎng)時(shí)間的霪雨天氣所致，它是人類生產(chǎn)生活以及社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的威脅之一。洪水不僅造成大量房屋倒塌和農(nóng)田被淹，危害到人民生命財(cái)產(chǎn)的安全，還對(duì)生態(tài)環(huán)境造成巨大的影響[1]。洪水可以造成嚴(yán)重的水土流失；可以攜帶大量泥沙、農(nóng)藥殘留物以及工業(yè)廢渣等大量污染物進(jìn)入河流[2]，使河道污染物總量增加；可以影響動(dòng)植物棲息地的環(huán)境，而且影響動(dòng)植物的生存和繁衍[3]；可以沖洗鹽堿化土壤表面的鹽堿，補(bǔ)充沼澤和湖泊的水量，改進(jìn)植物的生長(zhǎng)狀態(tài)和生物多樣性條件[1,4]。

微生物是地球上進(jìn)行物質(zhì)循環(huán)的生物地球化學(xué)過(guò)程的主力軍，微生物群落的構(gòu)成直接影響它們的功能[5-6]。洪水作為一種水流運(yùn)動(dòng)的突發(fā)狀況，對(duì)河流是一種干擾，這種干擾是否會(huì)重塑河流中的微生物群落的組成？如果這種干擾可以改變微生物群落的結(jié)構(gòu)，這種驅(qū)動(dòng)因素是什么？2012年8月，受第10號(hào)臺(tái)風(fēng)"達(dá)維"影響，遼寧省發(fā)生強(qiáng)降雨過(guò)程，發(fā)生了歷史罕見的洪災(zāi)。大凌河是受影響嚴(yán)重的河流，本研究選取的研究區(qū)域位于錦州河口段，覆蓋約80km，河流寬度在2—30m，深度在0.5—3m。收集了洪水暴發(fā)前后大凌河表層水樣，研究洪水干擾對(duì)河流浮游細(xì)菌群落的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

圖1 采樣點(diǎn)分布圖

本研究的樣品于2012年5月和2012年8月采自遼寧省錦州段大凌河流域表層水，具體布點(diǎn)如圖1，本研究沿河流共設(shè)17個(gè)位點(diǎn)，采樣點(diǎn)多數(shù)位于郊區(qū)，由于當(dāng)?shù)馗鞣N改造工程的進(jìn)行，有些位點(diǎn)只采集到1次，可參見表1。水樣經(jīng)300目的無(wú)菌紗布過(guò)濾除去大型顆粒和雜質(zhì)，取 300ml，用0.22um的硝酸纖維素膜過(guò)濾收集微生物于濾膜上，濾膜在-80℃冷凍保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水樣理化因素的測(cè)定

溶解氧(DO)由溶氧儀雷磁GTB-607A測(cè)定，pH值由pH計(jì)雷磁THB-1測(cè)定，鹽度S由鹽度計(jì)測(cè)定，總氮量、氨氮含量、總磷量、磷酸鹽的測(cè)定參照《水質(zhì)分析方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)匯編》中提供的方法進(jìn)行。

1.2.2 DNA的提取

將水樣濾膜從-80℃冰箱中取出，將濾紙剪碎后，利用CTAB法提取DNA[7]。利用Nanodrop對(duì)DNA的純度進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

DNA的濃度進(jìn)行定量后，以提取的水樣微生物DNA為模板，用引物對(duì)U968-GC-F(5′CGCCCGGGGCGCG-CCCCGGGCGGGGCGGGGGCAGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC3′)和L1401-R(5′CGGTGTGTACAAGACC-C3′)擴(kuò)增16SrDNA的V6-V8區(qū)，擴(kuò)增程序如下：94℃ 5min，(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min)30 cycles，72℃ 10min,4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，利用灰度分析將上樣量調(diào)整到400 ng，進(jìn)行變性梯度凝膠電泳。聚丙烯酰胺凝膠的濃度為8%，變性濃度為45%—65%。電泳程序：120V 17h，60℃保溫。電泳結(jié)束后，進(jìn)行硝酸銀染色，然后利用GS-800光密度掃描儀成像。

1.3 數(shù)據(jù)分析

DGGE圖譜利用Quantity one對(duì)主要條帶進(jìn)行灰度分析，導(dǎo)出相應(yīng)的灰度值矩陣?；叶戎颠M(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后利用Canoco4.5對(duì)矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，導(dǎo)出多樣性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；結(jié)合環(huán)境監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行RDA分析，分析結(jié)果進(jìn)行蒙特卡羅檢驗(yàn)，置換次數(shù)為999，可以顯著解釋響應(yīng)變量的環(huán)境變量被選入模型。兩次采集水樣間環(huán)境因素經(jīng)SPSS中單因素ANOVA進(jìn)行均值的顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 洪水前后大凌河水樣微生物群落的相似性分析

將樣品根據(jù)位點(diǎn)的特征分為5個(gè)區(qū)域：R0-R4為河流的上游段；R5為工業(yè)排污口；R6，R7為河流下游段；R8，R9，R10為潮汐性淡水海水混合區(qū)；R10-R16為長(zhǎng)期海水影響區(qū)，該區(qū)域在最小潮時(shí)仍然發(fā)生淡水海水的混合。

所有水樣16SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性梯度凝膠電泳后得到指紋圖譜，如圖2，條帶分離清晰，樣品間的主要微生物不同，河流中的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。

圖2 兩次采集水樣的微生物16SrDNA的DGGE指紋圖

為了進(jìn)一步理解這種差異，對(duì)2012年5月和2012年8月的樣品微生物群落組成進(jìn)行了主成分分析(圖3)。2012年5月洪水發(fā)生前，大凌河表層水樣按照樣品采樣點(diǎn)的環(huán)境特征分開，環(huán)境特征相似的樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)相似(圖3)；2012年8月洪水發(fā)生后，除工業(yè)排污口與其他位點(diǎn)的微生物群落結(jié)構(gòu)有巨大差異外，其余大凌河表層水樣散在分布(圖3)。以上研究表明洪水的發(fā)生改變了水流中的微生物群落結(jié)構(gòu)。

圖3 兩次采集水樣微生物群落的PCA分析

圖4 兩次采集水樣細(xì)菌群落的多樣性分析

圖5 兩次采集水樣理化因素條形圖

對(duì)5個(gè)區(qū)域中的微生物群落多樣性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，表明在洪水發(fā)生前大凌河河流表層水中的微生物群落的香農(nóng)指數(shù)H′有增加的趨勢(shì)，特別是在海水影響區(qū)，洪水發(fā)生后大凌河河流表層水中的微生物群落的多樣性指數(shù)有降低的趨勢(shì)，海水影響區(qū)在洪水發(fā)生前后多樣性指數(shù)差異顯著(P<0.05)(圖4)。對(duì)河流表層細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，洪水發(fā)生后微生物群落的多樣性指數(shù)均值由3.04降到2.84，變異系數(shù)由0.06升到0.11。

2.2 洪水前后大凌河水樣微生物群落與環(huán)境變量間的RDA分析

對(duì)各水樣的溶氧、pH值、鹽度、氨氮、總氮、磷酸鹽、總磷進(jìn)行了測(cè)定(表1)。對(duì)兩次樣品的環(huán)境變量進(jìn)行均值比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明:pH、S存在極顯著性差異(P<0.01)，TP存在顯著性差異(P<0.05)，其他因素存在差異，但不顯著(圖5)?？梢姾樗陌l(fā)生對(duì)于水流環(huán)境有很大的影響。

上述數(shù)據(jù)表明洪水發(fā)生前后，水環(huán)境發(fā)生了劇烈改變，而其中的微生物群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化，那么水樣中哪些環(huán)境變量能夠解釋微生物群落的結(jié)構(gòu)？本文利用RDA分析對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行了進(jìn)一步研究。在洪水發(fā)生前，水流中微生物群落的結(jié)構(gòu)主要受pH和S的影響，在洪水發(fā)生后，水流中的微生物群落主要受TP的影響(圖6)。

表1 兩次采集水樣的理化因素的測(cè)定

圖6 兩次采集水樣微生物群落和環(huán)境變量的RDA分析

3 結(jié)論與討論

微生物廣泛地存在于各種環(huán)境中，在生物地球化學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。微生物時(shí)刻受到各種自然壓力的選擇[8-9]。洪水作為一種劇烈的自然干擾對(duì)農(nóng)業(yè)，畜牧業(yè)[10]及生態(tài)環(huán)境有很大的影響。NATHAN R. DE JAGER[11]發(fā)現(xiàn)隨著洪水的發(fā)生頻率和時(shí)間的增長(zhǎng)，小樹種減少，耐受性物種規(guī)模增大。Chih-Ching Chung[12]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江洪災(zāi)影響聚球藻屬在中國(guó)東海表層水中的生態(tài)分布。這些提示洪水可以對(duì)生態(tài)環(huán)境形成選擇壓力。

洪水發(fā)生前，PCA分析顯示水樣依據(jù)水流環(huán)境聚集在一起，分別為河流上游、排污口、河流下游、淡水海水混合區(qū)、海水影響區(qū)五類。有研究發(fā)現(xiàn)微生物群落的類型具有棲息地選擇性[13-14]。在洪水發(fā)生前，表層水中的微生物群落結(jié)構(gòu)非常符合這一現(xiàn)象，也說(shuō)明河流表層微生物群落在各自的棲息環(huán)境中進(jìn)行進(jìn)化，形成了環(huán)境依賴的特征。對(duì)這5個(gè)區(qū)域的微生物多樣性的趨勢(shì)分析也表明：洪水改變了微生物群落多樣性沿河流的升高的趨勢(shì)，與環(huán)境因素的改變和洪水的稀釋作用有關(guān)。RDA分析洪水發(fā)生前的環(huán)境因素對(duì)于表層水中微生物群落結(jié)構(gòu)的解釋作用，發(fā)現(xiàn)pH和S是主要的環(huán)境解釋因素。pH和S是已研究的環(huán)境因素中對(duì)生物群落的形成具有非常重要的因子[15-17]。已有研究表明：土壤pH對(duì)濕地植物的分布具有很大的影響[18]，土壤微生物群落對(duì)pH變化敏感[19]，海洋的酸化過(guò)程會(huì)影響海洋微生物的多樣性[20]。在水生態(tài)系統(tǒng)中，鹽度可以控制微生物的分布[21-22]，形成明顯的淡水微生物群和海水微生物群。洪水發(fā)生前水流中微生物的解釋變量為pH和S，也進(jìn)一步說(shuō)明該河段表層水中微生物群落形成了環(huán)境依賴性的結(jié)構(gòu)。

洪水發(fā)生后，河道水位急速上升，水量增大，環(huán)境數(shù)據(jù)顯示水流中的pH和S都明顯下降，這與洪水的稀釋作用有關(guān)，氨氮、總氮、磷酸鹽、總磷的濃度也發(fā)生變化。對(duì)河流表層微生物群落的PCA分析表明：微生物群落在洪水后各樣點(diǎn)根據(jù)河道自然環(huán)境特征聚集的特點(diǎn)消失，而是趨于散在分布。洪水流經(jīng)農(nóng)田，道路等將非土著性微生物帶入河道，而河流的稀釋導(dǎo)致原環(huán)境中微生物濃度的稀釋，在這種條件下微生物在改變的新環(huán)境中迅速建立起新的群落結(jié)構(gòu)，這也就解釋了散在性分布的原因。從RDA分析的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，洪水后，影響微生物群落結(jié)構(gòu)的主要解釋變量為TP。而河流表層水中的TP在洪水發(fā)生前后有顯著性差異。磷是浮游植物和細(xì)菌生長(zhǎng)的必需元素，磷的缺失可以限制他們的生長(zhǎng)[23]。磷是農(nóng)田的主要肥料之一，突發(fā)洪水將大量農(nóng)田中的磷元素帶入河流，從而促進(jìn)了微生物群落的重塑。磷的富集是導(dǎo)致淡水和近海岸赤潮的發(fā)生的原因之一[24-25]。在一些富營(yíng)養(yǎng)區(qū)海灣，磷是具有限制性的元素[26]，突發(fā)洪水可能將大量磷元素帶入，提高了風(fēng)險(xiǎn)。

結(jié)論：在自然條件下，河流表層水中的浮游細(xì)菌群落在各自的環(huán)境條件下進(jìn)行進(jìn)化，這種進(jìn)化導(dǎo)致的結(jié)果與所處生態(tài)位的環(huán)境特征相關(guān)，當(dāng)強(qiáng)烈的外界因素如洪水介入后，會(huì)改變河流固有的環(huán)境特征，特別是限制性元素磷的重新分布，從而對(duì)微生物群落造成重塑，重塑導(dǎo)致的微生物群落變化，會(huì)帶來(lái)未知的危害，如赤潮等災(zāi)害的發(fā)生，本研究可以為淡水和近海岸災(zāi)害的發(fā)生提供依據(jù)。

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Effect of the flood on the bacterial community of bacteriaplankton in Daling River

GUO Jianguo, ZHAO Longhao, XU Dan, SUN Yeqing*

InstituteofEnvironmentalSystemsBiology,DalianMaritimeUniversity,Dalian116026,China

The flood often causes damage to human and the environment. In order to determine whether the flood can affect the bacterial community which plays an important role in the process of geobiochemistry, we collected the surface water samples along Daling River before and after the flood in 2012. We analyzed the bacterial community of the samples using DGGE, combined with statistic methods PCA and RDA. The results were as follows: (1) The flood had a great effect on the bacterial community of bacteriaplankton in the river. Before the flood occured, the PCA result showed that samples formed clusters according to their natural habitat types, while this relationship disppeared after the flood. (2)The bacterial community was primely shaped by pH and salinity which was determined in other studies as well before the flood, while the main explanatory environmental factor was total phosphorus after the flood. Therefore,we came to a conclusion that the flood can shape the bacterial community by the shift of the environmental characteristic such as total phosphorus.

bacterial community; flood; DGGE; surface water

國(guó)家科技支撐項(xiàng)目(2010BAC68B02); 大連市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011E11SF007)

2013-12-29;

2014-09-09

10.5846/stxb201312293053

*通訊作者Corresponding author.E-mail: yqsun@dlmu.edu.cn

郭建國(guó), 趙龍浩, 徐 丹, 孫野青.洪水對(duì)大凌河河流浮游細(xì)菌群落的影響.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(14):4777-4783.

Guo J G, Zhao L H, Xu D, Sun Y Q.Effect of the flood on the bacterial community of bacteriaplankton in Daling River.Acta Ecologica Sinica,2015,35(14):4777-4783.