王麗娜, 余 正, 田 野, 張文靜, 楊 軍

1 中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所， 城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 水生態(tài)健康研究組, 廈門(mén) 361021 2 廈門(mén)大學(xué)海洋與地球?qū)W院, 廈門(mén) 361102 3 中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院, 武漢 430074 4 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

基于克隆文庫(kù)技術(shù)分析瘤棘砂殼蟲(chóng)的食物組成

王麗娜1,4, 余 正1,4, 田 野1,3, 張文靜2, 楊 軍1,*

1 中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所， 城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 水生態(tài)健康研究組, 廈門(mén) 361021 2 廈門(mén)大學(xué)海洋與地球?qū)W院, 廈門(mén) 361102 3 中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院, 武漢 430074 4 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049

瘤棘砂殼蟲(chóng)是東亞特有的原生動(dòng)物，廣泛分布于長(zhǎng)江與珠江中下游以及福建地區(qū)的湖泊和水庫(kù)，作為水生態(tài)系統(tǒng)的捕食者，在維持水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能方面發(fā)揮著重要作用。利用18S rRNA基因PCR擴(kuò)增和克隆文庫(kù)測(cè)序等分子生物學(xué)技術(shù)方法，從基因水平研究瘤棘砂殼蟲(chóng)的食物組成。結(jié)果表明：所獲得的46條序列在97%相似度水平含有11類(lèi)OTUs(Operational taxonomic units，操作分類(lèi)單元)，其中包括輪蟲(chóng)6個(gè)，橈足類(lèi)5個(gè)，說(shuō)明瘤棘砂殼蟲(chóng)的捕食類(lèi)群以輪蟲(chóng)和橈足類(lèi)為主，同時(shí)也證明單細(xì)胞生物可以直接以多細(xì)胞的后生動(dòng)物為食。此外，通過(guò)克隆文庫(kù)測(cè)序技術(shù)分析原生動(dòng)物的食物組成比例，不僅是一種方便、高效、快速，重復(fù)性高的方法，同時(shí)也為分析原生動(dòng)物的生態(tài)功能提供了一種新的視角。

18S rRNA基因; 克隆文庫(kù); 砂殼蟲(chóng); 捕食; 原生動(dòng)物

砂殼蟲(chóng)(Difflugia)廣泛分布于世界各地，是淡水生境中豐度和多樣性最高的有殼蟲(chóng)原生動(dòng)物，特別是在湖泊水庫(kù)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)等關(guān)鍵生態(tài)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。然而，長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)有殼蟲(chóng)食性了解極為有限，并且以往的研究主要限于顯微鏡觀察，認(rèn)為其主要以藻類(lèi)和真菌為食物[1]。瘤棘砂殼蟲(chóng)(Difflugiatuberspinifera)是東亞特有的淡水自由生原生動(dòng)物，首次在中國(guó)貴州烏江渡被發(fā)現(xiàn)[2]，蟲(chóng)體大小100—120 μm，廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江與珠江中下游以及福建地區(qū)的湖泊和水庫(kù)中[3-6]。近年來(lái)，韓博平等[6-7]首次報(bào)道瘤棘砂殼蟲(chóng)以攝食水中的微小顆粒及輪蟲(chóng)為主，說(shuō)明單細(xì)胞生物可以捕食多細(xì)胞的后生浮游生物。事實(shí)上，原生動(dòng)物是經(jīng)典食物鏈與微食物網(wǎng)的關(guān)鍵連接點(diǎn)，因此，在維持水生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能等方面具有重要的地位和意義[8]。

目前國(guó)際學(xué)者對(duì)砂殼蟲(chóng)的研究重點(diǎn)聚焦于形態(tài)學(xué)、分類(lèi)學(xué)、生態(tài)學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育等方面。楊軍等[3, 9]綜合運(yùn)用現(xiàn)代分類(lèi)學(xué)技術(shù)方法對(duì)瘤棘砂殼蟲(chóng)進(jìn)行了系統(tǒng)分類(lèi)描述，利用X射線能譜儀分析淡水瘤棘砂殼蟲(chóng)殼體元素，發(fā)現(xiàn)其殼體化學(xué)元素組成介于海洋和土壤有殼蟲(chóng)之間；Wanner等[10]通過(guò)形態(tài)計(jì)量學(xué)方法，揭示了有殼蟲(chóng)適應(yīng)不同環(huán)境的各種機(jī)制；Gomaa等[11]基于SSU rRNA基因序列在分子水平上進(jìn)一步確定砂殼蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育地位。韓博平等[6]基于顯微觀察首次發(fā)現(xiàn)瘤棘砂殼蟲(chóng)能夠捕食輪蟲(chóng)，這些研究結(jié)果都為砂殼蟲(chóng)捕食特性的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。近幾年，在福建多個(gè)水庫(kù)中發(fā)現(xiàn)大量瘤棘砂殼蟲(chóng)，為了更清楚地了解瘤棘砂殼蟲(chóng)的捕食習(xí)性和食物組成，首次嘗試將分子生物學(xué)技術(shù)引入到砂殼蟲(chóng)食物組成的研究中。本研究采用構(gòu)建克隆文庫(kù)的分子生物學(xué)方法分析砂殼蟲(chóng)食物組成。通過(guò)采集樣品，分離活體瘤棘砂殼蟲(chóng)，對(duì)總DNA提取，設(shè)計(jì)18S rRNA基因特異引物，構(gòu)建克隆文庫(kù)并進(jìn)行有效序列的分析，進(jìn)而分析食物的物種組成。此方法操作簡(jiǎn)單，試驗(yàn)周期短，重復(fù)性好，為研究砂殼蟲(chóng)攝食行為特點(diǎn)提供了新的研究手段。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2010年9月在廈門(mén)市湖邊水庫(kù)(24°30′N(xiāo)，118°09′E)水體表層水平及垂直方向上利用網(wǎng)孔直徑為64 μm的浮游生物網(wǎng)拖拽撈取樣品，將水樣轉(zhuǎn)入50 mL PVC瓶，并快速送至實(shí)驗(yàn)室。在倒置顯微鏡下挑取瘤棘砂殼蟲(chóng)蟲(chóng)體，超純水清洗體表3—5次，以避免外源DNA的污染。選取50個(gè)個(gè)體裝入1.5 mL的無(wú)菌離心管中。置于-20 ℃保存，以備進(jìn)行總DNA提取。

1.2 DNA提取

配制異硫氰酸胍法DNA提取液[12]，將瘤棘砂殼蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到含有100 μL DNA提取液的離心管中，輕微震蕩?；靹蚝?，置于65 ℃水浴鍋加熱10—30 min，利用無(wú)菌槍頭破碎蟲(chóng)體。再加入100 μL異丙醇，震蕩混勻，置于4℃冰箱中沉淀過(guò)夜。次日，取出冰箱中的樣品，在4 ℃，14000 r/min條件下離心20 min，棄上清液。將預(yù)冷的250 μL 70%乙醇加入沉淀物DNA中，混勻漂洗，在4 ℃，14000 r/min條件下離心5 min，棄上清液。再加入250 μL無(wú)水乙醇洗滌DNA，在4 ℃，14000 r/min條件下離心5 min，棄上清液。將沉淀物置于無(wú)菌處風(fēng)干1 min，加入適量蒸餾水溶解所提取的DNA，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因的PCR擴(kuò)增及純化

選擇18S rRNA基因通用引物Euk-A(5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′)和 Euk-B(5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′)為PCR擴(kuò)增引物[13]。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括5 μL 10 × Ex PCR緩沖液(10 mmol/L，Mg2+終濃度為1.5 mmol/L)，4 μL dNTP(10 mmol/L)，0.25 μL Ex Taq酶(5 U/μL)，PCR前后引物各1 μL(10 μmol/L)，36.75 μL ddH2O和2 μL DNA模板。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性4 min；40個(gè)循環(huán)為94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min；最后72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用經(jīng)EB染色的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。從凝膠上切下特異性擴(kuò)增的目的條帶，置于無(wú)菌的1.5 mL Eppendorf管中，利用凝膠回收試劑盒(Wizard? SV Gel and PCR Clean-up System)純化回收18S rRNA基因片段。

1.4 測(cè)序及序列分析

將純化后的PCR產(chǎn)物(18S rRNA基因)連接到pGEM-T載體，然后導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。涂布到含有50%氨芐青霉素(Ampicillin)的LB固體培養(yǎng)基上孵育、培養(yǎng)并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取出白色克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)。將正確插入目的片段的50個(gè)白色克隆樣品進(jìn)行基因測(cè)序分析，應(yīng)用DNASTAR軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行編輯，去除載體序列。將所獲的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中進(jìn)行比對(duì)，挑選與其親緣關(guān)系最相近的已知序列以確定其分類(lèi)歸屬。利用Mothur v.1.22.2軟件分析操作分類(lèi)單元(OTUs，Operational taxonomic units)，按97%的相似度進(jìn)行劃分。基于OTU結(jié)果，計(jì)算Chao1值、ACE值[14-15]，并繪制稀釋曲線。

1.5 序列登錄號(hào)

本研究獲得的18S rRNA基因序列在GenBank中的登錄號(hào)為：KF910075—KF910085。

2 結(jié)果

2.1 18S rRNA基因多樣性分析

本研究中，PCR擴(kuò)增獲得的18S rRNA基因片段大小約為1500 bp。對(duì)挑選的50個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析，除4個(gè)低質(zhì)量克隆未成功測(cè)序外，共得到46條序列。

46條基因序列在97%相似度水平歸為11類(lèi)OTU(圖1)。多樣性指數(shù)Chao1值為32，ACE指數(shù)為74。其中，OTU1及OTU2豐度最高，各自包含了12條序列，表明OTU1及OTU2在砂殼蟲(chóng)體內(nèi)豐度較高(圖2)。OTU3是8條序列，OTU4有7條序列。其他7個(gè)OTU均包括1條序列，相對(duì)豐度較低。

2.2 食物組成

基于系統(tǒng)發(fā)育地位分析表明，所有OTUs均可劃歸為兩大類(lèi)浮游動(dòng)物：52%的OTUs序列屬于輪蟲(chóng)(Rotifera)，48%的OTUs序列是橈足類(lèi)(Copepoda)的哲水蚤(表1，圖3)。其中6個(gè)OTUs屬于輪蟲(chóng)，包括24條序列；5個(gè)OTUs屬于橈足類(lèi)，包括22條序列。由表1可知，輪蟲(chóng)主要種類(lèi)包括矩形龜甲輪蟲(chóng)(Keratellaquadrata)、對(duì)壺狀臂尾輪蟲(chóng)(Brachionusurceolaris)、大肚須足輪蟲(chóng)(Euchlanisdilatata)、方塊鬼輪蟲(chóng)(Trichotriatetractis)、萼花臂尾輪蟲(chóng)(Brachionuscalyciflorus)、剪形巨頭輪蟲(chóng)(Cephalodellaforficula)；橈足類(lèi)包括Mastigodiaptomusnesus(鏢水蚤科一種)，擬細(xì)真鏢水蚤(Eudiaptomusgraciloides)，Eudiaptomusgracilis(鏢水蚤科一種)，Skistodiaptomusoregonensis(鏢水蚤科一種)，Leptodiaptomusmoorei(鏢水蚤科一種)。以上結(jié)果提示，瘤棘砂殼蟲(chóng)體內(nèi)出現(xiàn)輪蟲(chóng)及橈足類(lèi)的18S rRNA基因，推測(cè)瘤棘砂殼蟲(chóng)不僅以輪蟲(chóng)為食，而且可以捕食橈足類(lèi)。

圖1 18S rRNA基因序列稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves for 18S rRNA gene sequences

圖2 18S rRNA基因克隆文庫(kù)中OTU0.03等級(jí)豐度 Fig.2 Rank-abundance distribution of OTU0.03 based on 18S rRNA gene clone library

表1 18S rRNA 基因測(cè)序條帶序列系統(tǒng)發(fā)育地位

3 討論

3.1 瘤棘砂殼蟲(chóng)的食物組成

基于顯微鏡觀測(cè)的研究表明，瘤棘砂殼蟲(chóng)屬肉食性動(dòng)物，會(huì)攻擊其周?chē)魏挝⑿〉纳铮绕涫谴笮∠嘟奈⑿蜕?，主要攝食以輪蟲(chóng)為主的浮游生物，包括膠鞘輪蟲(chóng)、獨(dú)角聚花輪蟲(chóng)、螺形龜甲輪蟲(chóng)、紅多肢輪蟲(chóng)、奇異六腕輪蟲(chóng)、對(duì)棘異尾輪蟲(chóng)，以及無(wú)節(jié)幼體[6-7,16]。瘤棘砂殼蟲(chóng)的捕食行為主要依賴偽足，偽足可以自由伸縮[17]，并且可以準(zhǔn)確判斷所要捕食對(duì)象的位置。在廣東流溪河水庫(kù)輪蟲(chóng)中，膠鞘輪蟲(chóng)和獨(dú)角聚花輪蟲(chóng)容易被瘤棘砂殼蟲(chóng)攝食，因?yàn)樗鼈兩眢w柔軟、游泳速度慢；而龜甲輪蟲(chóng)、紅多肢輪蟲(chóng)的外殼硬，游泳速度快，不易被瘤棘砂殼蟲(chóng)捕食[7,16]。針對(duì)不同輪蟲(chóng)物種，瘤棘砂殼蟲(chóng)的捕食方式是不一樣的。如遇到身體柔軟的膠鞘輪蟲(chóng)，瘤棘砂殼蟲(chóng)一般會(huì)攻擊它們的背部或尾部，容易捕食成功；而對(duì)于外殼比較硬的龜甲輪蟲(chóng)，選擇先攻擊它們的口部，捕食成功率較低[6,16]。毫無(wú)疑問(wèn)，我們的結(jié)果也進(jìn)一步表明，作為單細(xì)胞的瘤棘砂殼蟲(chóng)能夠捕食多細(xì)胞的后生動(dòng)物(表1)。

有趣的是，除了在瘤棘砂殼蟲(chóng)體內(nèi)檢測(cè)到輪蟲(chóng)18S rRNA基因序列外，還檢測(cè)到相當(dāng)比例的橈足類(lèi)，進(jìn)而證明湖邊水庫(kù)瘤棘砂殼蟲(chóng)主要以輪蟲(chóng)及橈足類(lèi)為食。本研究檢測(cè)到瘤棘砂殼蟲(chóng)捕食的輪蟲(chóng)及橈足類(lèi)種屬與韓博平等[6-7,16]學(xué)者觀察到的物種有所差異，推測(cè)這與不同生境及被捕食物種的豐富度相關(guān)。同時(shí)，本研究進(jìn)一步補(bǔ)充擴(kuò)展了瘤棘砂殼蟲(chóng)捕食對(duì)象的范圍。由于橈足類(lèi)的個(gè)體相對(duì)于瘤棘砂殼蟲(chóng)要大很多，所以捕食相對(duì)較難。最近，韓博平等[16]觀察到瘤棘砂殼蟲(chóng)可以捕食其周?chē)劳龅臉镒泐?lèi)，但關(guān)于活體橈足類(lèi)的捕食尚未見(jiàn)報(bào)道。不過(guò)，本文推測(cè)瘤棘砂殼蟲(chóng)能夠捕食橈足類(lèi)幼體，因?yàn)闃镒泐?lèi)幼體個(gè)體相對(duì)較小，并且經(jīng)歷的幼體階段相對(duì)較長(zhǎng)。

事實(shí)上，瘤棘砂殼蟲(chóng)還會(huì)捕食藻類(lèi)，包括甲藻、絲狀藻類(lèi)等[6]。但在本研究中沒(méi)有檢測(cè)到藻類(lèi)，這并不代表瘤棘砂殼蟲(chóng)沒(méi)有捕食藻類(lèi)。究其原因，一方面可能是我們所用的18S rRNA基因引物具有一定特異性，擴(kuò)增序列產(chǎn)生一定的偏好性，導(dǎo)致沒(méi)有檢測(cè)到藻類(lèi)。另一方面，瘤棘砂殼蟲(chóng)捕食的其他類(lèi)食物數(shù)量不夠多，或者已經(jīng)消化掉了，低于檢測(cè)線，因而也沒(méi)能檢測(cè)到。未來(lái)的深入研究有必要篩選更合適的PCR擴(kuò)增引物和優(yōu)化PCR條件。

表2 顯微觀察方法與分子技術(shù)手段的比較

3.2 基因克隆文庫(kù)技術(shù)是一個(gè)有效的食物組成分析方法

傳統(tǒng)的單細(xì)胞生物食物組成和捕食行為研究主要是利用顯微活體觀察技術(shù)，在觀察時(shí)需要具有分類(lèi)學(xué)背景的專(zhuān)業(yè)人才，處理大量樣本耗時(shí)較長(zhǎng)，因此分析周期長(zhǎng)[18]。而近年來(lái)興起的分子生物學(xué)技術(shù)方法的方便、高效、快速，彌補(bǔ)了活體觀察的這一缺陷。本研究中，利用18S rRNA基因序列克隆文庫(kù)的分子生物學(xué)技術(shù)手段，能夠發(fā)現(xiàn)瘤棘砂殼蟲(chóng)體內(nèi)含有輪蟲(chóng)及橈足類(lèi)的基因序列，證明此方法可行可信。因此，單細(xì)胞原生動(dòng)物體內(nèi)18S rRNA基因的檢測(cè)可以作為一個(gè)有用的工具來(lái)快速地分析瘤棘砂殼蟲(chóng)的食物組成。雖然分子生物學(xué)技術(shù)手段能夠快速檢測(cè)食物組成，但不能直觀地觀測(cè)其捕食行為過(guò)程，因此要配合顯微鏡活體觀察來(lái)共同研究瘤棘砂殼蟲(chóng)的捕食特征(表2)。

為進(jìn)一步深入全面認(rèn)知瘤棘砂殼蟲(chóng)的捕食行為特征，揭示其在水生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能等方面的重要作用和意義，建議后續(xù)研究綜合顯微活體觀察與分子生物學(xué)方法，達(dá)到技術(shù)方法上相互補(bǔ)充的效果。

[1] Meisterfeld R. Order Arcellinida Kent, 1880//Lee J J, Leedale G F, Bradbury P. An Illustrated Guide to the Protozoa. 2nd ed. Lawrence, USA: Allen Press, 2002: 827-860.

[2] 胡東利, 沈韞芬, 顧曼如, 龔循矩. 武陵山地區(qū)原生動(dòng)物新種和新紀(jì)錄//宋大祥. 西南武陵山地區(qū)無(wú)脊椎動(dòng)物. 北京: 科學(xué)出版社, 1997: 40-72.

[3] Yang J, Beyens L, Shen Y F, Feng W S. Redescription ofDifflugiatuberspiniferaHu, Shen, GuetGong, 1997 (Protozoa: Rhizopoda: Arcellinida: Difflugiidae) from China. Acta Protozoologica, 2004, 43(3): 281-289.

[4] 劉樂(lè)冕, 楊軍, 張文靜, 余正. 原生動(dòng)物瘤棘砂殼蟲(chóng)六個(gè)自然種群的形態(tài)計(jì)量學(xué)分析. 動(dòng)物學(xué)研究, 2010, 31(4): 435-443.

[5] Yu Z, Zhang W J, Liu L M, Yang J. Evidence for two different morphotypes ofDifflugiatuberspiniferafrom China. European Journal of Protistology, 2014, 50(2): 205-211.

[6] Han B P, Wang T, Lin Q Q, Henri J D. Carnivory and active hunting by the planktonic testate amoebaDifflugiatuberspinifera. Hydrobiologia, 2008, 596(1): 197-201.

[7] Wang T, Han B P. Food selectity ofDifflugiatuberspiniferain Liuxihe Reservoir, South China. Ecological Science, 2008, 27(5): 398-401.

[8] 沈韞芬. 西藏高原的原生動(dòng)物//蔣燮治, 沈韞芬, 龔循矩. 西藏水生無(wú)脊椎動(dòng)物. 北京: 科學(xué)出版社, 1983: 48-100.

[9] 楊軍, Beyens L, 沈韞芬, 馮偉松. 瘤棘砂殼蟲(chóng) (肉足亞門(mén): 根足總綱) 殼體元素組成. 動(dòng)物學(xué)研究, 2004, 25(5): 452-455.

[10] Wanner M. A review on the variability of testate amoebae: methodological approaches, environmental influences and taxonomical implications. Acta Protozoologica, 1999, 38(1): 15-29.

[11] Gomaa F, Todorov M, Heger T J, Mitchell E A D, Lara E. SSU rRNA phylogeny of Arcellinida (Amoebozoa) reveals that the largest Arcellinid Genus,DiffugiaLeclerc 1815, is not monophyletic. Protist, 2012, 163(3): 389-399.

[12] Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry, 1987, 162(1): 156-159.

[13] Medlin L K, Elwood H J, Stickel S, Sogin M L. The characterization of enzymatically amplified eukaryotic 16S-like rRNA-coding regions. Gene, 1998, 71(2): 491-499.

[14] Hill T C J, Walsh K A, Harris J A, Moffett B F. Using ecological diversity measures with bacterial communities. FEMS Microbiology Ecology, 2003, 43(1): 1-11.

[15] Kemp P F, Aller J Y. Bacterial diversity in aquatic and other environments: what 16S rDNA fibraries can tell us. FEMS Microbiology Ecology, 2004, 47(2): 161-177.

[16] Han B P, Wang T, Xu L, Lin Q Q, Zhang J Y, Dumont H J. Carnivorous planktonicDifflugia(Protista, Amoebina Testacea) and their predators. European Journal of Protistology, 2011, 47(3): 214-223.

[17] 張文靜, 楊軍, 田野. 有殼肉足蟲(chóng)的結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)以及生殖. 生物學(xué)通報(bào), 2010, 45(1): 12-14.

[18] Gilbert D, Mitchell E A, Amblard C, Bourdier G, Francez A J. Population dynamics and food preferences of the testate amoebaNebelatinctamajor-bohemica-collariscomplex (Protozoa) in aSphagnumPeatland. Acta Protozoologica, 2003, 42(2): 99-104.

Diet composition ofDifflugiatuberspinifera(testate amoeba) based on a clone library technique

WANG Lina1,4, YU Zheng1,4, TIAN Ye1,3, ZHANG Wenjing2, YANG Jun1,*

1AquaticEcoHealthGroup,KeyLaboratoryofUrbanEnvironmentandHealth,InstituteofUrbanEnvironment,ChineseAcademyofSciences,Xiamen361021,China2CollegeofOceanandEarthSciences,XiamenUniversity,Xiamen361102,China3SchoolofEnvironmentalStudies,ChinaUniversityofGeosciences(Wuhan),Wuhan430074,China4UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China

Difflugiais a morphologically diverse genus of the free-living shelled amoeboid protozoa that are important components of freshwater ecosystems and play crucial roles in nutrient cycles and energy flow through food webs.Difflugiatuberspiniferais an endemic species of East Asia and is widely distributed in freshwater lakes and reservoirs in China. Clearly, this species plays a critical role in maintaining the structure and function of freshwater ecosystems. However, little is known about its diet composition and predatory behavior at both species and gene levels. This testate amoeba (D.tuberspinifera) was first found in the Wujiang River, Guizhou Province, China. Subsequently, more detailed studies on its morphology and biometry have been done on natural populations from Yangtze River and Pearl River valleys, and Fujian reservoirs. Recently, Han et al. illustrated thatD.tuberspiniferais an active and agile hunting carnivore that can capture swimming prey including micro-particulates, rotifers, and other metazoans. In previous studies, however, the specimen identifications were done by microscopic examination, which requires a broad and deep taxonomic knowledge and is very laborious, time-consuming, and somewhat variable because of insufficient taxonomic resolution. In order to facilitate the identification of diet composition inD.tuberspinifera, an inexpensive, efficient, rapid and easy-to handle gene clone library has been developed for diet detection and analysis. The plankton samples were collected from the Hubian Reservoir in Xiamen city in September of 2010. Individual cells were isolated using a glass capillary under an inverted microscope and washed 3—5 times with distilled water before DNA extraction and PCR amplification. The 18S rRNA gene was amplified by the universal eukaryotic primers, and the purified PCR products were ligated into the pGEM-T vector and transformed intoEscherichiacoliDH5α-competent cells. In total, 46 plasmids containing target gene fragments were successfully identified and sequenced. Each sequence was compared with sequences available in the GenBank database using BLAST, and the closest relatives were identified for diet or food composition analysis. Finally, 11 OTUs (operational taxonomic units) were identified at 97% sequence similarity level, and they belonged to either Rotifera (52%) or Copepoda (48%). Our results, combined with existing data, suggested that: 1) the diet composition ofDifflugiatuberspiniferais composed of both rotifera and copepoda species; 2) unicellular protozoa are not only the food of metazoa, but they can also prey on multicellular micro-metazoa; 3) molecular methods are universally applicable, and the SSU rRNA (small subunit ribosomal RNA) gene clone library is an efficient, rapid, and repeatable approach to study the diet composition of protozoa.

18S rRNA gene; clone library;Difflugia; predation; prozotoa

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172114, 30800097); 福建省杰出青年科學(xué)基金項(xiàng)目(2012J06009)

2014-01-26;

日期:2014-11-19

10.5846/stxb201401260195

*通訊作者Corresponding author.E-mail: jyang@iue.ac.cn

王麗娜, 余正, 田 野, 張文靜, 楊軍.基于克隆文庫(kù)技術(shù)分析瘤棘砂殼蟲(chóng)的食物組成.生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(18):6183-6188.

Wang L N, Yu Z, Tian Y, Zhang W J, Yang J.Diet composition ofDifflugiatuberspinifera(testate amoeba) based on a clone library technique.Acta Ecologica Sinica,2015,35(18):6183-6188.