肖麗 姜達

乳腺癌血管生成擬態(tài)及其與基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達的相關性研究

肖麗 姜達

目的 探討乳腺癌中是否存在血管生成擬態(tài)(VM)，并通過研究其與基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)表達的相關性，初步探討VM形成的機制。方法 選取女性乳腺癌的石蠟標本共146例作為試驗組，再選取20例女性乳腺的良性病變作為對照組，進行過碘酸雪夫氏反應以及CD34的雙重染色，觀察VM是否存在，再對VM陽性者和陰性者均進行MMP-2染色，比較二者相互關系。結果 VM的陽性表達與腫瘤大小、病理分級和淋巴結轉移有關(P＜0.05)。高分化和中低分化乳腺癌組織中VM的陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在有淋巴結轉移的乳腺癌組織中及無淋巴結轉移的乳腺癌組織中VM的陽性率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。MMP-2在乳腺癌組織中表達陽性率與乳腺良性病變比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。MMP-2在乳腺癌組織中的陽性表達率與病理學分級、淋巴結轉移有關。高分化的乳腺癌組織MMP-2陽性率和中低分化乳腺癌組織比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。有淋巴結轉移的乳腺癌組織MMP-2陽性率和無淋巴結轉移的乳腺癌組織比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。MMP-2在VM陽性組中陽性表達率顯著高于陰性組，二者在乳腺癌組織中的表達呈正相關性(r=0.550，P＜0.05)。結論 乳腺癌是中存在VM的，MMP-2表達同VM具有相關性。

血管生成擬態(tài);基質(zhì)金屬蛋白酶-2;乳腺腫瘤

腫瘤生長、轉移有賴于新的血管的不斷生成。Maniotis等［1］于1999年在研究人眼的葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)時發(fā)現(xiàn)了一種新的、與原來經(jīng)典的腫瘤血管的生成途徑絕對不一樣的、不依賴于內(nèi)皮細胞的全新的腫瘤血管生成的新的模式，其稱這種模式為血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)。目前在卵巢癌、炎性乳腺癌、前列腺癌及肝癌等多種組織中均發(fā)現(xiàn)VM的存在。MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶的重要成員，在乳腺癌促使腫瘤生長、擴散［2］。目前關于VM與乳腺浸潤性導管癌及MMP-2相關性的研究比較少。本研究擬通過進行CD34和PAS雙重染色觀察乳腺浸潤性導管癌中是否存在著VM，同時進一步探討MMP-2與乳腺癌中VM及腫瘤轉移的關系，從而探討具有VM的腫瘤是否更加具有侵襲性、轉移性及提示更差預后。

1 材料與方法

1.1 標本與試劑

1.1.1 標本來源:146例乳腺癌標本(試驗組)來自河北省滄州中西醫(yī)結合醫(yī)院2006至2010年手術切除乳腺癌的存檔蠟塊?；颊咝g前未經(jīng)過新輔助化療，石蠟切片經(jīng)多位高年資病理醫(yī)師確診為乳腺浸潤性導管癌?；颊呔鶠榕裕挲g27～80歲，平均47歲;腫瘤直徑1～7.5 cm;腋窩淋巴結陽性90例，陰性56例;根據(jù)WHO(1981)乳腺癌分類標準方法進行組織學分級，其中Ⅰ級(高分化)30例，Ⅱ+Ⅲ級(中低分化)116例。另選20例乳腺良性病變(乳腺纖維腺瘤10例、乳腺增生10例)作對照。

1.1.2 主要試劑:MMP-2單克隆抗體、CD34單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒及糖原染色試劑盒均購于福州邁新公司。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)免疫組織化學實驗步驟:免疫組織化學SP法。蠟塊4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物的活性，檸檬酸緩沖液微波法修復，加入抗體，4℃過夜;DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精復染，0.1%鹽酸分化，PBS返藍;切片經(jīng)梯度乙醇脫水干燥，中性樹膠封固。已知陽性切片作陽性對照;PBS液代替一抗作空白對照。

1.2.2 CD34與 PAS 雙重染色步驟:首先進行 CD34免疫組織化學染色，DAB顯色后，顯微鏡下觀察，待血管內(nèi)皮細胞著色后，水流沖洗1 min終止顯色反應。將切片置于0.5%的過碘酸溶液中氧化10 min，水流沖洗10 min后置于Schiff液中，避光環(huán)境下PAS液反應15 min，棄去 Schiff液，直接滴加偏重亞硫酸鈉溶液2次，1 min/次，蒸餾水沖洗2次，1 min/次。自來水沖洗2 min，蒸餾水返色10 min以上。蘇木精淺染細胞核，脫水、透明，中性樹膠封片。

1.3 結果判斷

1.3.1 VM的判定:管道外周是一層厚薄不均勻的過碘酸雪夫氏(PAS)反應陽性、CD34染色陰性的物質(zhì)構成的界膜，管腔內(nèi)壁沒有血管內(nèi)皮細胞的覆蓋，周圍沒有出血壞死和炎性細胞浸潤［3］。

1.3.2 MMP-2染色結果判定:在細胞膜或細胞質(zhì)有棕黃色顆粒沉著者為陽性。陽性細胞數(shù)目評分:無陽性細胞為0分，陽性細胞數(shù)＜25%為1分，陽性細胞25% ～50%為2分，陽性細胞51% ～75%為3分，陽性細胞＞75%為4分。染色強度分級:無染色為0分，弱染色為1分，中等強度染色為2分，強染色為3分，計算各抗體的染色的強度和陽性細胞數(shù)之和，以3～7分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，相關性檢驗采用Spearman相關統(tǒng)計法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌與VM

2.1.1 乳腺浸潤性導管癌中存在VM:HE染色下可見由腫瘤細胞圍成的類似管道樣的結構，內(nèi)可見紅細胞，管道內(nèi)壁無內(nèi)皮細胞，管腔內(nèi)未見壞死崩解的炎性細胞及腫瘤細胞，不同于腫瘤中心區(qū)域常見的壞死灶。PAS、CD34雙重染色后可見由PAS陽性物質(zhì)圍成的基底膜樣結構將腫瘤細胞和紅細胞分開。圍成管腔的細胞因CD34染色均陰性，結合細胞異型性，證實其不是內(nèi)皮細胞，而是癌細胞。本研究中146例乳腺癌組織中有38例存在VM，其表達率為26.0%(38/146)，對照組的乳腺良性組織中未發(fā)現(xiàn)VM。見圖1～8。

2.1.2 VM與乳腺癌臨床病理特征的關系:VM的陽性表達與患者年齡無關(P＞0.05)，而與腫瘤大小、病理分級和淋巴結轉移有關(P＜0.05)。高分化和中低分化乳腺癌組織中VM的陽性率分別為0(0/30)和32.8%(38/116)，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。在有淋巴結轉移的乳腺癌組織中及無淋巴結轉移的乳腺癌組織中VM的陽性率分別為40%(36/90)和3.6%(2/56)，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。同時發(fā)現(xiàn)VM的陽性率與臨床分期有關系，分期越晚，陽性率越高，但因樣本量有限，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

圖1 試驗組乳腺癌組織中的VM(如箭頭所示)(HE×100)

圖2 試驗組乳腺癌組織中的VM(如箭頭所示)(HE×400)

圖3 試驗組乳腺癌組織中的VM(如箭頭所示)(PAS+CD34×100)

圖4 試驗組乳腺癌組織中的VM(如箭頭所示)(PAS+CD34×400)

圖5 對照組對照組中無VM(HE×100)

圖6 對照組中無VM(HE×400)

圖7 對照組中無 VM(PAS+CD34×100)

圖8 對照組中無VM(PAS+CD34×400)

表1 VM和病理參數(shù) 例

2.2 MMP-2在乳腺癌中的表達

2.2.1 MMP-2在乳腺癌和乳腺良性病變組織中的表達比較:MMP-2在乳腺癌組織中表達陽性率為71.9%(105/146)，在乳腺良性病變(乳腺纖維腺瘤，乳腺增生)中的表達陽性率為20%(4/20)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。研究中還發(fā)現(xiàn)MMP-2在乳腺癌組織中表達強度較乳腺良性組織中明顯增強，但因樣本量小，統(tǒng)計學無意義。見表2，圖9～12。

表2 2組MMP-2的表達 例

圖9 試驗組MMP-2在VM陽性的乳腺癌組織中的表達(綠色箭頭標注VM，紅色箭頭標注MMP-2陽性細胞)(HE×100)

圖10 試驗組MMP-2在VM陽性的乳腺癌組織中的表達(綠色箭頭標注VM，紅色箭頭標注MMP-2陽性細胞)(HE×400)

圖11 對照組MMP-2在對照組組織中的表達(如箭頭所示)(HE×100)

圖12 對照組MMP-2在對照組組織中的表達(如箭頭所示)(HE×400)

2.2.2 MMP-2與乳腺癌臨床病理特征的關系:MMP-2在乳腺癌組織中的陽性表達率與患者年齡以及腫瘤大小均無關(P＞0.05)，與病理學分級、淋巴結轉移有關。在高分化的乳腺癌組織和中低分化乳腺癌組織中，MMP-2 陽性率分別為 53.3%(16/30)和 76.7%(89/116)，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。在有淋巴結轉移的乳腺癌組織和無淋巴結轉移的乳腺癌組織中，MMP-2 陽性率分別為 82.2%(74/90)和 55.4%(31/56)，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見表3。

2.3 VM與MMP-2 38例乳腺癌VM陽性組織中有38例MMP-2陽性表達，陽性率為100%(38/38)，即全部陽性表達，在108例乳腺癌VM陰性的組織中有67例MMP-2陽性表達，其陽性率為62.0%(68/108)。MMP-2在VM陽性組中陽性表達率顯著高于陰性組，二者在乳腺癌組織中的表達有顯著相關性(r=0.550，P ＜0.05)。見表 4。

表3 MMP-2和病理參數(shù) 例

表4 VM和MMP-2相關性 例

3 討論

3.1 乳腺癌與VM 侵襲和轉移是惡性腫瘤顯著的、獨特的生物學特性，此兩種特性需依賴于血液的供應、細胞移動分子、一些細胞黏附分子和各種降解酶的參與。Maniotis等［1］發(fā)現(xiàn)了一種全新的腫瘤血管生成模式—VM。VM指某些惡性細胞發(fā)生基因逆轉，回到多潛能未分化的胚胎樣細胞表型，模擬內(nèi)皮細胞，自身變形，與細胞外基質(zhì)互相作用，模仿血管壁的結構，形成可運輸血液的管道系統(tǒng)，重新塑造腫瘤微循環(huán)，并相連于宿主血管，使腫瘤獲得相應的血液供應。此特性在一定程度上說明了存在VM的腫瘤更具有轉移能力及侵襲性，臨床上的表現(xiàn)就是患者預后較差［4］。近幾年的研究表明，VM存在于多種腫瘤組織中，如肺癌、肝癌［5］、卵巢癌［6］、消化道腫瘤［7］、炎性乳癌［8］、睪丸生殖細胞惡性腫瘤［9］等。本研究結果顯示，146例乳腺癌組織經(jīng)CD34與PAS雙重染色，其中38例的標本中可見VM。該結果與Shirakawa等［9］在炎性乳癌中的研究結果相一致。近幾年關于VM與腫瘤臨床分期相關性的研究也很多。承澤農(nóng)等［10］在對非小細胞肺癌VM的研究中發(fā)現(xiàn)具有VM的腫瘤具有低分化、臨床分期晚以及更易發(fā)生淋巴結轉移的特征。本研究也發(fā)現(xiàn)類似特點，但因樣本量小，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

3.2 MMP-2與乳腺癌 惡性腫瘤的浸潤、轉移是眾多因子互相協(xié)調(diào)、共同作用的結果［11］。這一過程中，基底膜破壞和細胞外基質(zhì)的降解是一個重要的、并且是始終貫穿的因素。MMPs就是這一過程中不可缺少的酶類。MMP-2是MMPs家族中主要成員之一，分子量72 kD，由腫瘤細胞、間質(zhì)細胞以酶原形式分泌。杜日昌等［12］研究發(fā)現(xiàn)在食管癌的發(fā)生、浸潤、轉移的過程，有MMP-2存在，且其促進食管癌的侵襲、轉移。Jones等［13］發(fā)現(xiàn) MMP-2在正常的乳腺組織和乳腺良性腫瘤中無表達或低表達，而在乳腺癌組織中，它的表達和活性均顯著增強。已知的MMP-2在乳腺癌浸潤和轉移的機制包括［14］:降解細胞外基質(zhì)、調(diào)節(jié)細胞間的黏附、促進新生血管形成。在本研究中，MMP-2在乳腺癌中的陽性表達率為71.9%，顯著高于乳腺良性病變中20%的陽性表達率，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。MMP-2的過表達與乳腺癌組織學分級有關，病理學分級越低，腫瘤細胞的胞漿、細胞膜染色就越深，MMP-2的陽性表達率也就越高(P ＜0.05)，在有淋巴結轉移乳腺癌組織中的陽性表達率顯著增高，明顯高于無淋巴結轉移組織的陽性表達率(P＜0.05)，與患者年齡無關。上述研究結果與其他研究者在胃癌、直腸癌、胰腺癌的研究中的表達相似［15，16］。目前有很多人在研究MMP-2與臨床分期的相關性。夏慶安等［17］在對乳腺癌組織中 MMP-2的研究中發(fā)現(xiàn)MMP-2高表達與腫瘤的TNM分期、淋巴結轉移和預后復發(fā)相關。本研究也發(fā)現(xiàn)類似的相關性，但樣本量小，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。由此可說明乳腺惡性腫瘤細胞在發(fā)生浸潤、轉移的過程中，MMP-2的表達及其活性起著十分重要的作用。檢測MMP-2，可有效評估乳腺癌的預后，并早期采取治療措施。對于那些分化程度低、惡性程度較高、轉移發(fā)生早的乳腺癌，可通過控制MMP-2機制，達到控制乳腺癌細胞的浸潤、轉移的目的。

3.3 MMP-2 與 VM Hess等［18］在對惡性黑色素瘤VM的研究中發(fā)現(xiàn)，MMP-2是VM的重要載體。在本研究中，在38例存在VM的乳腺癌組織中，MMP-2全部陽性表達，在108例VM陰性的乳腺癌組織中有67例MMP-2陽性表達，有VM組的MMP-2陽性表達率顯著高于無VM組的陽性表達率。二者在乳腺癌組織中的表達呈正相關(r=0.550，P ＜0.05)，說明在乳腺癌浸潤轉移的VM機制中MMP-2同樣起著非常重要的作用，或者說兩者之間存在密切關聯(lián)。

本研究小組目前仍在繼續(xù)該領域的研究，采用RT-PCR、Western blot等方法檢測乳腺癌組織中VM表達情況、MMP-2表達情況，及其與臨床分期等臨床病理特征的關系。

有研究表明，抗腫瘤血管生成抑制劑對VM的作用不明顯，故設計抗腫瘤血管生成的方法時，應該考慮其對VM的作用，可通過抵抗MMP-2等黏附分子表達，來干擾腫瘤細胞重塑等機制，達到抑制VM生成，阻斷腫瘤血液供應的目的，為治療高度惡性腫瘤提供更多的思路與機會。

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Correlation between vascularization mimesis and expression of matrix metalloproteinase-2 in breast cancer

XIAO Li*，JIANG Da.*Department of Oncology，Integrated Traditional Chinese Medicine-Western Medicine Hospital，Hebei，Cangzhou 061001，China

ObjectiveTo investigate whether there exists vascularization mimesis(VM)in breast cancer，and to research the correlation between vascularization mimesis and expression of matrix metalloproteinase-2(MMP-2)in order to explore formative mechanism of VM.MethodsOne hundred and forty-six paraffin-embedded specimens of breast cancer were selected as trial group，and 20 benign breast lesion specimens were served as control group，All the specimens were stained by PAS and CD34，then VM was observed，moreover，these specimens were stained by MMP-2，and the correlation between positive VM and negative VM was analyzed.ResultsThe positive expression of VM was correlated to tumor size，pathological grading，lymph node metastasis.There were significant differences in the positive expression rates of VM between well differentiated tissues of breast cancer and medium differentiated，poor differentiated tissues of breast cancer(P ＜ 0.05).There was a significant difference in the positive rate of VM between breast cancer tissue with lymph node metastasis and breast cancer tissue without lymph node metastasis(P ＜0.05).There was a significant difference in the positive expression rate of MMP-2 between breast cancer tissue and breast benign lesion(P ＜ 0.05).There were significant differences in the positiveexpression rates of MMP-2 among different pathological grades as well as with or without lymph node metastasis(P＜0.05).There was a significant difference in the positive expression rate of MMP-2 between well differentiated tissues of breast cancer and medium differentiated，poor differentiated tissues of breast cancer(P ＜0.05).The positice expression rates of MMP-2 in positive VM group were significantly higher than those in negative VM group.ConclusionVM exists in breast cancer，moreover，the expression of MMP-2 is positively correlated to VM.

vascularization mimesis;matrix metalloproteinases;breast neoplasms

R 737.9

A

1002－7386(2015)14－2085－05

10.3969/j.issn.1002 －7386.2015.14.001

061001 河北省滄州中西醫(yī)結合醫(yī)院腫瘤內(nèi)科(肖麗);河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院東院區(qū)腫瘤內(nèi)科(姜達)

姜達，050035 石家莊市，河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院東院區(qū)腫瘤內(nèi)科;E-mail:jiangda139@163.com

2015－01－19)