艾月琴 趙 華 江龍委 賈紹昌

解放軍第八一醫(yī)院腫瘤生物治療科，江蘇南京 210002

腎癌是一種嚴重危害人類健康的惡性疾病。大多數(shù)晚期腎癌對放化療不敏感，且預后較差[1]。細胞免疫治療對腫瘤的生物治療取得了良好效果，并逐漸成為腫瘤治療的重要手段之一。近年細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer，CIK）的免疫功能得到廣泛研究。CIK 細胞作為一種新型的廣譜抗腫瘤免疫細胞，不僅具有強大的廣譜抗腫瘤效應，而且可以調(diào)節(jié)增強腫瘤患者的免疫功能[2-5]。樹突狀細胞（dendritic cells，DC）是特異性免疫的始動者，能將抗原呈遞給免疫效應細胞，據(jù)文獻報道可以增強CIK 細胞的細胞毒活性[6-7]。 索拉菲尼（Sorafenib）是一種選擇性抑制腫瘤細胞增殖和組織中腫瘤學血管生成的多靶點抗腫瘤藥物，可同時抑制絲氨酸/蘇氨酸和受體酪氨酸激酶，具有良好的抗腫瘤活性[8]。本研究小組進行了自體DCCIK 細胞聯(lián)合索拉非尼治療24 例晚期腎癌患者，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2011 年12 月～2014 年3 月解放軍第八一醫(yī)院行自體DC-CIK 聯(lián)合索拉菲尼治療的晚期腎癌患者24 例。所有患者均經(jīng)病理學確診為腎癌，其中透明細胞癌18 例，顆粒細胞癌4 例，乳頭狀細胞癌2 例。24 例患者中男14 例，女10 例，年齡27～71 歲，中位年齡為57 歲。 所有患者均為晚期腎癌， 其中肺轉(zhuǎn)移22 例，肝轉(zhuǎn)移4 例，骨轉(zhuǎn)移14 例，腦轉(zhuǎn)移2 例，其他12 例。 其中15 例為術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移，病灶轉(zhuǎn)移均2 處及以上。 卡氏評分（KPS）＜80 分16 例，≥80 分8 例。病例排除標準：懷孕及哺乳期婦女；患有自身免疫性疾病；感染活動狀態(tài)；嚴重凝血異常；既往有生物制品過敏者。所有臨床試驗程序均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準，全部受試患者均簽署自體免疫細胞治療知情同意書。

1.2 DC 及CIK 細胞的制備及回輸方法

對患者行單個核細胞采集， 采集終產(chǎn)品經(jīng)Ficoll密度梯度離心法離心， 吸取中間白色分層， 洗滌、計數(shù)，鋪入75 cm2培養(yǎng)瓶，加X-VIVO 培養(yǎng)液至濃度為2×106/mL，搖勻，平放于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 h，待貼壁細胞貼壁后，吸取上清，將其中的懸浮細胞用于CIK 培養(yǎng)， 剩下的貼壁細胞進行DC 培養(yǎng)。DC 制備：在貼壁細胞瓶中加入含重組人粒細胞單核細胞集落刺激因子（rhGM-CSF）（500 U/mL）及重組人白細胞介素4（rhIL-4）（10 ng/mL）的X-VIVO 培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第3 天、第5 天半量換液，第6 天加入負荷抗原（與患者病理組織學相近的同種異體腫瘤細胞株裂解物）， 第7 天加入腫瘤壞死因子α（TNF-α）（500 U/mL），第8 天收獲腫瘤抗原致敏的DC 疫苗，-80℃冰箱凍存。 治療當天將DC 細胞復蘇， 復蘇的DC 細胞置于20 mL 生理鹽水中備用。 CIK 制備： 將懸浮細胞按1×106/mL 置于含GTT551 培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中， 內(nèi)含終濃度1000 U/mL 的重組人γ 干擾素（rhIFN-γ）；孵育24 h 后加入終濃度500 U/mL 的重組人白細胞介素2（rhIL-2）和50 ng/mL的anti-CD3 mAb 繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d 補液1 次，保持細胞密度在（1～2）×106/mL，適時分瓶培養(yǎng)。 觀察細胞的擴增數(shù)量、狀態(tài)及成熟度，在細胞成熟后收集細胞。收集的CIK 細胞置于100 mL 生理鹽水中備用。

1.3 治療方法

患者行單個核細胞采集后第2 天行索拉非尼治療，400 mg/次，2 次/d， 若無明顯不良反應則連續(xù)服用。 外周血單個核細胞（PBMC）采集后經(jīng)實驗室培養(yǎng)1 周后進行DC 細胞淋巴結(jié)區(qū)皮下注射，1 次/周，共4 次；PBMC 采集后經(jīng)實驗室培養(yǎng)8～10 d，進行CIK 細胞靜脈回輸，隔天1 次，共3 次。 每次回輸DC 細胞不少于1×107，CIK 細胞不少于1×109。 4 次DC 治療加3 次CIK 治療為1 個周期。 每間隔1 個月重復DC-CIK 細胞治療1 個周期， 每位患者至少行1 個周期的DCCIK 細胞治療。 治療期間白細胞計數(shù)＜3×109/L 或肝功能異常者停藥8 周后進行評價，對藥物反應性好及可耐受者停藥休息2～4 周繼續(xù)下1 個周期治療。在治療前1 個月內(nèi)行CT 檢查，每2 個月行CT 檢查1 次。

1.4 淋巴細胞亞群檢測

每次DC-CIK 治療前及治療結(jié)束后檢測患者的外周抗凝血， 分三組加入流式抗體， 第一組CD3-ECD、CD4-PC5、CD8-FITC；第二組CD4-PC5、CD25-PE；孵育20 min 后加入紅細胞裂解液繼續(xù)孵育10 min；低速離心機中離心，離心機半徑13.5 cm，轉(zhuǎn)速3000 r/min，離心5 min 后PBS 洗滌2 次，制成單細胞懸液后上機檢測，檢測結(jié)果用CXP（v2.1）軟件分析。不同淋巴細胞亞群的標記如下：總T 細胞（CD3+）、輔助性T 細胞Th （CD3+CD4+）、 細胞毒性T 細胞Tc（CD3+CD8+）、調(diào)節(jié)性T 細胞Treg（CD4+CD25+）。

1.5 療效與安全性評價

在患者接受完最后1 次細胞治療后1 個月進行免疫反應及臨床療效評估， 在治療后3 個月再次評估，之后每3～6 個月復查評估。 近期療效評估按實體瘤療效評價標準（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）分為完全緩解（complete remission，CR）、部分緩解（partial remission，PR）、病情穩(wěn)定（stable disease，SD）和疾病進展（progressive disease，PD），患者至少4 周以后進行療效確認。 以CR+PR 計算治療有效率（response rate，RR），以CR+PR+SD 計算疾病控制率（disease control rate，DCR）。 生活質(zhì)量評價根據(jù)患者KPS 評分：KPS 增加≥10 分為改善；變化＜10 分為穩(wěn)定，減少≥10 分為降低。 不良反應根據(jù)美國國立癌癥研究所《常見不良反應標準》（NCI-CTCAE v4.0）進行判定。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行分析。 計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料以均數(shù)±標準差（s）表示，兩組間比較采用t 檢驗（正態(tài)分布時）或者Wilcoxon 秩和檢驗（非正態(tài)分布時），同一樣本治療前后比較采用配對t 檢驗。 以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DC 和CIK 培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)流式細胞儀檢測，DC 及CIK 細胞表型符合DC 及CIK 的特征。CIK 細胞在第3 天后開始增殖，第5～6 天快速增長。 在回輸入患者體內(nèi)前，收獲CIK 細胞分析其表型及細胞毒性。CIK 細胞效靶比為5∶1 時，CIK 細胞對MCF-7 的細胞毒活性為50.6%， 而正常外周單核細胞的細胞毒性僅為9.4%，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。

2.2 免疫治療前后患者外周血免疫學指標變化

24 例患者中，19 例患者行1 個周期細胞治療，4 例患者行2 個周期細胞治療，1 例患者行3 個周期細胞治療。索拉非尼聯(lián)合自體DC-CIK 細胞治療后與治療前比較，患者外周血淋巴細胞亞群檢測示，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均明顯上升，而CD8+T 淋巴細胞比例、CD4+CD25+Treg 細胞比例下降明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。 見表1。

表1 患者治療前后外周血淋巴細胞亞群的變化（%，s）

表1 患者治療前后外周血淋巴細胞亞群的變化（%，s）

時間 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ CD4+CD25+治療前治療后P 值55.97±11.71 67.80±8.50 0.018 30.18±8.33 40.40±7.71 0.021 25.41±6.22 17.34±4.52 0.005 1.08±0.60 1.89±0.53 0.011 7.12±1.71 4.57±1.56 0.034

2.3 臨床療效觀察

所有患者隨訪10～40 個月。24 例患者中CR 2 例（8.3%），PR 4 例（16.7%），SD 15 例（62.5%），PD 3 例（12.5%）；RR 為25.0%，DCR 為87.5%。隨訪截止日期為2015 年4 月，其中6 例死亡，18 例存活。

2.4 生活質(zhì)量

部分患者經(jīng)DC、CIK 細胞免疫治療后自覺生活質(zhì)量有所提升，具體表現(xiàn)為食欲增強、睡眠改善、疼痛減輕、體力較前好轉(zhuǎn)、索拉非尼治療的不良反應減輕。所有患者治療前平均KPS 評分為（56.5±7.0）分，治療后平均KPS 評分為（75.7±7.3）分，治療前后差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。治療后生活質(zhì)量改善14 例（58.3%），穩(wěn)定6 例（25.0%），降低4 例（16.7%）。

2.5 不良反應

DC-CIK 細胞免疫治療后，不良反應一般出現(xiàn)在回輸后1～2 h。 其中發(fā)熱12 例，持續(xù)時間2～8 h，自行緩解7 例，5 例給予藥物對癥處理后緩解；皮疹16 例，均為1～2 級；血壓升高10 例；Ⅰ度轉(zhuǎn)氨酶升高1 例；Ⅱ度腹瀉2 例。 所有不良反應均未達3～4 級。

3 討論

腎癌是起源于腎實質(zhì)中泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，是一種嚴重危害人類健康的惡性疾病。 目前為止， 根治性腎癌手術(shù)仍為治療腎癌的主要方法，但并非所有腎癌患者均可手術(shù)根治。 統(tǒng)計表明，患者中確診時發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的約占25%，術(shù)后患者出現(xiàn)復發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者占30%，且大多數(shù)轉(zhuǎn)移性腎癌對放化療不敏感，預后較差。 細胞免疫治療及分子靶向藥物對腫瘤的生物治療取得了良好效果，并逐漸成為腎癌治療的重要手段之一[9-10]。

索拉菲尼是由德國Bayer 公司研發(fā)的靶向抗腫瘤藥物，于2005 年獲美國FDA 批準用于治療晚期腎細胞癌。 索拉菲尼是首個口服多激酶抑制劑，靶向作用于腫瘤細胞以及腫瘤血管內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶受體和酪氨酸激酶受體，具有雙重抗腫瘤作用，既能通過抑制Raf/MEK/ERK 信號傳導通道直接抑制腫瘤生長，又能通過抑制與新生血管生成和腫瘤生長有關(guān)的酪氨酸激酶受體的活性， 阻斷腫瘤新生血管的生成，間接抑制腫瘤細胞生長[11-12]。 在多個臨床及臨床前試驗中均顯示，索拉菲尼對晚期腎癌具有良好的治療效果，是晚期腎癌治療的重大進展[13-15]。但是索拉非尼單一治療腎癌僅短期內(nèi)獲得較好的治療效果，長期生存時間并未獲得明顯改善。 因此，索拉非尼需要與其他的治療方法聯(lián)合，以期提高晚期腎癌的療效。

細胞免疫治療是一種新型的腫瘤治療手段，DC及CIK 是其中重要的兩種細胞。 DC 通過識別、攝取、提呈腫瘤抗原，可激活特異性抗腫瘤免疫[16]。CIK 是人工培育的一種異質(zhì)性的免疫細胞， 既具有T 細胞特性，也具有NK 細胞特性，具有廣譜抗腫瘤作用[17-18]。本研究對24 例晚期腎癌患者給予自體DC-CIK 細胞聯(lián)合索拉非尼治療的效果進行了探討。 結(jié)果顯示24例患者中CR 2 例（8.3%），PR 4 例（16.7%），SD 15 例（62.5%），PD 3 例（12.5%）；RR 為25.0%，DCR 為87.5%。這證明索拉菲尼聯(lián)合細胞免疫治療能使患者獲得一定的臨床獲益。

腫瘤最終得以發(fā)展，一方面說明機體的免疫功能出現(xiàn)了缺陷， 誘導的免疫反應不足以對抗腫瘤細胞；另一方面也與腫瘤細胞自身的各種免疫逃逸有關(guān)。研究顯示，機體內(nèi)淋巴細胞的比例與機體免疫功能息息相關(guān)， 其中淋巴細胞亞群中CD3+總T 細胞比例及CD4+/CD8+比值與腫瘤患者的抗腫瘤免疫功能相關(guān)，CD3+T 細胞比例、CD4+T 細胞比例及CD4+/CD8+比值與腫瘤的病變程度呈負相關(guān)。同時，CD4+CD25+Treg 細胞是免疫負性細胞，具有抑制抗腫瘤免疫的功能[19-21]。本研究結(jié)果顯示， 經(jīng)細胞治療聯(lián)合索拉菲尼治療后，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均明顯上升， 而CD8+T 淋巴細胞比例、CD4+CD25+Treg 細胞比例下降明顯，證明聯(lián)合治療能加強患者抗腫瘤免疫功能。

DC-CIK 治療的安全性較高，與其相關(guān)的不良反應一般出現(xiàn)在回輸1～2 h。其中發(fā)熱12 例，皮疹16 例，血壓升高10 例，所有不良反應均未達3～4 級，提示細胞免疫治療的安全性有所保障。

綜上所述，自體DC-CIK 細胞聯(lián)合索拉非尼治療晚期腎癌，能夠使患者獲得一定的臨床獲益，改善患者免疫功能，并有效改善患者的生活質(zhì)量，且發(fā)生的不良反應大都在可耐受范圍， 具有臨床使用價值，值得進一步擴大樣本研究證實。

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