張 亮，林霏申，侯文潔，錢(qián)智磊，丁紅梓＊（.南京市胸科醫(yī)院藥學(xué)部，南京 009；.南京市胸科醫(yī)院結(jié)核科，南京 009）

·藥劑·

HPLC法測(cè)定血漿中異煙肼和乙酰異煙肼的質(zhì)量濃度及異煙肼在老年患者體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

張 亮1，林霏申2，侯文潔1，錢(qián)智磊1，丁紅梓1＊（1.南京市胸科醫(yī)院藥學(xué)部，南京 210029；2.南京市胸科醫(yī)院結(jié)核科，南京 210029）

目的 建立高效液相色譜法測(cè)定患者血漿中異煙肼和乙酰異煙肼質(zhì)量濃度的方法，并對(duì)目前應(yīng)用較多的老年肺結(jié)核患者進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究。方法 10名老年患者，年齡大于65歲，診斷為肺結(jié)核，口服給予異煙肼0.3g，不同時(shí)間采集患者血樣，用HPLC法測(cè)定血漿藥物質(zhì)量濃度，用DAS3.1軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果 用非房室模型計(jì)算出了異煙肼在患者體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確，適用于體內(nèi)異煙肼藥代動(dòng)力學(xué)分析。異煙肼在老年患者的藥代動(dòng)力學(xué)特征與年輕人群的藥代動(dòng)力學(xué)特征存在差異。

異煙肼；乙酰異煙肼；藥代動(dòng)力學(xué)；高效液相色譜法

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）每年會(huì)導(dǎo)致數(shù)百萬(wàn)人死亡［1］。異煙肼（INH）是治療各種結(jié)核病最常用的藥物之一，它與利福平（RFP）、吡嗪酰胺（PZA）和乙胺丁醇（EMB）組成的HREZ方案是目前初始抗結(jié)核治療的標(biāo)準(zhǔn)方案［2］。然而，INH的體內(nèi)代謝卻有著明顯的個(gè)體差異，快代謝型的患者會(huì)由于體內(nèi)INH不能長(zhǎng)時(shí)間維持在較高濃度而無(wú)法達(dá)到預(yù)期的治療效果。乙酰異煙肼（AcINH）是INH最主要的代謝產(chǎn)物，也是肝毒性最大的物質(zhì)。它是INH在肝臟內(nèi)經(jīng)乙?；傻?，該過(guò)程分為快乙?；吐阴；?。乙?；?lèi)型的不同不但會(huì)導(dǎo)致治療效果出現(xiàn)差異，而且對(duì)肝臟的毒副作用也有明顯區(qū)別。目前的研究普遍認(rèn)為，慢乙酰化代謝者更容易發(fā)生藥物性肝損害［3］。因此，如何盡可能提高療效且不發(fā)生藥物性肝損害就成為結(jié)核病治療中的關(guān)鍵所在。我們?nèi)舳ㄆ诒O(jiān)測(cè)患者服藥后血漿中AcINH的質(zhì)量濃度，就可判斷患者是屬于快代謝型還是慢代謝型［4］。然后再將INH和AcINH的血藥質(zhì)量濃度相結(jié)合來(lái)調(diào)整INH的給藥劑量，就可以提高療效并降低藥物性肝損害的發(fā)生率。此外，肺結(jié)核的治療通常為聯(lián)合治療，藥物聯(lián)用也會(huì)對(duì)INH的血藥質(zhì)量濃度產(chǎn)生影響。因此，對(duì)結(jié)核患者進(jìn)行血質(zhì)量低濃度監(jiān)測(cè)是有必要的。

目前，雖然有很多種高效液相色譜（HPLC）的方法來(lái)對(duì)抗結(jié)核藥物進(jìn)行含量分析［5－7］，但這些方法都不能用來(lái)分析成分極為復(fù)雜的血漿中的藥物質(zhì)量濃度。本文用HPLC建立了同時(shí)檢測(cè)INH和AcINH血藥質(zhì)量濃度的方法。由于老年患者對(duì)藥物代謝能力的差異更大，所以本研究在建立方法學(xué)的基礎(chǔ)上初步考察了INH在老年結(jié)核病患者體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC－20AB高效液相色譜儀（島津，日本）；渦旋儀（WH－2，上海滬西分析儀器廠有限公司）；電子分析天平（EB224，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；高速離心機(jī)（TG1650－WS，上海盧湘儀）；微量移液器（Eppendorf，德國(guó)）。

1.2 試藥 異煙肼對(duì)照品（批號(hào)：100578－200401，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；乙酰異煙肼對(duì)照品（批號(hào)：3－JES－102－4，Toronto Research Chemicals Inc.）；茶堿對(duì)照品（批號(hào)：100121－199903，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；甲醇（Merck公司，德國(guó)），為色譜純；磷酸二氫鉀、三乙胺（中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)）均為分析純。水為雙蒸水（用Millipore儀器自制，美國(guó)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS－SP（150mm× 4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）﹕0.05mol·L－1磷酸二氫鉀（B）（三乙胺調(diào)pH 5.6）（梯度為1～10 min：A∶B為4∶98，10～11min梯度變?yōu)锳∶B為80∶20，11min：A∶B為80∶20，淋洗時(shí)間共20min）；柱溫：40℃；流速：1mL·min－1；進(jìn)樣體積：20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：261nm。

2.2 血漿樣品處理 取血漿樣品300μL，置于2 mL離心管中，精密加入2.4μg·mL－1茶堿甲醇溶液10μL作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，渦旋混勻1min，加700μL甲醇，旋渦混勻5min，以16 000r·min－1離心15min，取少量上清液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣分析。

2.3 方法專(zhuān)屬性 按照本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，INH和AcINH的分離度＞1.5，對(duì)測(cè)定不產(chǎn)生干擾，血漿中存在的雜質(zhì)峰對(duì)檢測(cè)不產(chǎn)生影響。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC圖A.空白血漿；B.空白血漿＋AcINH＋I(xiàn)NH；C.患者血漿；1.AcINH；2.INH；3.茶堿Fig.1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.plasma＋AcINH＋I(xiàn)NH；C.patient plasma sample；1.AcINH；2.INH；3.theophylline

2.4 線性關(guān)系 在10mL的量瓶中放入對(duì)照品，用甲醇溶解并稀釋至刻度。配成質(zhì)量濃度為1 000 μg·mL－1的INH和AcINH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取2mL離心管，每只加入不同量的INH和AcINH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及300μL·mL－1的空白血漿，使其中的藥物質(zhì)量濃度分別為0.15，0.3，0.6，1.2，2.4，4.8，9.6，19.2和38.4μg·mL－1。其后按2.2項(xiàng)下操作，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)、樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)作線性回歸。INH的線性方程：Y＝0.412 2C＋0.054 1（r2＝0.992 4），INH在0.15～38.4μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。AcINH的線性方程：Y＝0.170 8C＋0.053（r2＝0.992 1），AcINH在0.15～38.4μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度和準(zhǔn)確度 在空白血漿300μL中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，精確配制成含低、中、高3種質(zhì)量濃度（0.5，5和25μg·mL－1）的INH和AcINH血漿樣品，按2.2項(xiàng)下操作，測(cè)定日內(nèi)（5次）和日間（5d）精密度，RSD均小于10%。見(jiàn)表1。

表1 日間、日內(nèi)精密度Tab.1 The precision of intra－day and inter－day

2.6 穩(wěn)定性 在空白血漿300μL中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，精確配制成含低、中、高3種質(zhì)量濃度（0.5，5和25μg·mL－1）的INH和AcINH血漿樣品。于室溫下分別放置0，2，4，8和12h后，按2.2項(xiàng)下操作，測(cè)定峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值。由結(jié)果可知，12h內(nèi)樣品基本保持穩(wěn)定。見(jiàn)表2。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of stability test

2.7 回收率實(shí)驗(yàn) 在空白血漿300μL中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，精確配制成含低、中、高3種質(zhì)量濃度（0.5，5和25μg·mL－1）的INH和AcINH血漿樣品。于室溫下分別放置0，2，4，8和12h后，按2.2項(xiàng)下操作，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)5次，計(jì)算平均回收率和RSD。見(jiàn)表3。

表3 回收率測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of recovery rate

3 INH藥代動(dòng)力學(xué)研究

3.1 患者選擇 10名老年患者，年齡≥65歲；明確診斷為肺結(jié)核；治療方法為標(biāo)準(zhǔn)HREZ（異煙肼＋利福平＋乙胺丁醇＋吡嗪酰胺）方案。INH服藥方法：0.3g，每日1次，早飯后0.5h頓服。

3.2 血藥質(zhì)量濃度檢測(cè) 服藥前及服藥后的0，0.33，0.66，1.00，2.00，3.00，4.00，6.00，8.00，12.00和24.00h經(jīng)前臂靜脈取血3～5mL，立即置于涂有肝素的離心管中，在避光處?kù)o置10～20min，以5 000r·min－1離心處理10min，分離血漿，盡量在2h內(nèi)進(jìn)行分析，若不能及時(shí)分析在－40℃冰箱內(nèi)保存。

3.3 藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果 選取老年患者10名，男性6名，女性4名，年齡73.7±7.7歲，體質(zhì)量為64.2 ±13.5kg。這10名患者平均血藥質(zhì)量濃度－時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。將測(cè)得的質(zhì)量濃度取平均值，使用DSA 3.1對(duì)質(zhì)量濃度－時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4。

圖2 異煙肼在患者血漿中的藥物質(zhì)量濃度－時(shí)間曲線Fig.2 Concentration－time curve of INH in patient plasma

表4 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.4 The main pharmacokinetics of INH

4 討論

由于INH和AcINH屬于極性較強(qiáng)的物質(zhì)，其在色譜柱上保留時(shí)間比較短，并且容易受到外源性雜質(zhì)的影響。為了能夠得到較好的峰形和分離度，本實(shí)驗(yàn)嘗試使用了苯基柱和氰基柱［8－10］。雖然它們可以延長(zhǎng)在色譜柱上的保留時(shí)間，但峰形達(dá)不到分析的要求。經(jīng)過(guò)反復(fù)比較和實(shí)驗(yàn)，我們認(rèn)為在使用C18柱時(shí)，使用pH5.6的磷酸二氫鉀為緩沖對(duì)，并且在較高極性流動(dòng)相的洗脫下可以得到很好地分離。

在樣品前處理方法中，實(shí)驗(yàn)了液液萃取法，發(fā)現(xiàn)由于這3種組分的極性太大，用乙酸乙酯無(wú)法全部萃取出來(lái)，嚴(yán)重影響分析的準(zhǔn)確性。又嘗試了將沉淀蛋白后的上清液吹干后再用流動(dòng)相復(fù)溶，但這樣增加了操作步驟且給方法學(xué)的考察增加了難度，并且還需加入抗氧化劑，影響了多組分藥物的穩(wěn)定性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)和對(duì)比后，選擇使用甲醇沉淀蛋白后直接取上清液進(jìn)樣，該方法可以在不影響可靠性的前提下最大程度地減少操作步驟，可以方便臨床及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單，成本低，靈敏度不低于使用LC－MS的方法，即使樣本中藥物的含量低也能準(zhǔn)確測(cè)定。檢測(cè)時(shí)間符合要求，如果使用更長(zhǎng)的250mmC18柱還可以延長(zhǎng)保留時(shí)間，增加分離度。整個(gè)方法學(xué)的回收率高于80%，日間和日內(nèi)RSD小于10%，符合對(duì)生物樣品分析的要求。

有報(bào)道，INH在健康人群中的半衰期最大為3.5 h，但本研究發(fā)現(xiàn)老年患者的半衰期超過(guò)4h。表觀分布容積也大于文獻(xiàn)報(bào)道值［11－12］。這說(shuō)明老年患者的INH藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)與健康年輕人還是存在一定程度的差異。提示臨床設(shè)定治療方案時(shí)應(yīng)該特別注意不同人群的藥代動(dòng)力學(xué)特征。老年患者由于免疫力較弱，容易感染結(jié)核，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)這一人群探討了藥物體內(nèi)處置規(guī)律，研究具有較高的臨床適用性，提供了較為可靠的藥物體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，可以促進(jìn)臨床合理用藥，減少不良反應(yīng)的發(fā)生。

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Determination of isoniazid and acetylisoniazid in patient plasma by HPLC and study on pharmacokinetics of isoniazid in elder patients

ZHANG Liang1，LIN Feishen2，HOU Wenjie1，QIAN Zhilei1，Ding Hongzi1＊（1.Department of Pharmacy，Nanjing Chest Hospital，Nanjing 210029，China；2.Department of Tuberculosis，Nanjing Chest Hospital，Nanjing 210029，China）

Objective To determine the concentration of isoniazid（INH）and acetylisoniazid in patient plasma by HPLC and investigate INH′s pharmacokinetics in elder patients.Methods A single 0.3g dose of INH was given to 10tuberculosis patients with the age more than 65years old by oral administration route.Blood samples were preceded by protein precipitation and the plasma concentrations of INH were determined by an HPLC method，which was built in this study.Data were analyzed by the DAS3.1 software.Results The major pharmacokinetics parameters of INH were calculated by using non compartmental model.Conclusion The method described in this report was of high sensitivity and selectivity for accurate determination of the plasma concentration of INH in human.The results obtained from this study showed that the pharmacokinetics of INH in elder patients was significantly different from that in adult patients.

isoniazid；acetylisoniazid；pharmacokinetics；HPLC

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.020

R945

A

1004－2407（2015）04－0390－04

2014－11－19）

南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展重大項(xiàng)目（編號(hào)：ZHX13041）；南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項(xiàng)目（編號(hào)：YKK11064）；南京市胸科醫(yī)院青年人才培養(yǎng)計(jì)劃專(zhuān)項(xiàng)基金

張亮，男，碩士研究生

＊通信作者：丁紅梓，男，主管藥師