王 妍，王寶華，魯 冰，楊貝貝，李 萍，孟慶卿，季文琴（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102）

黃蜀葵花中黃酮類成分的含量測定及HPLC指紋圖譜研究

王 妍，王寶華＊，魯 冰，楊貝貝，李 萍，孟慶卿，季文琴（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102）

目的 采用高效液相色譜法建立黃蜀葵花的HPLC指紋圖譜，同時測定其中金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素和槲皮素的含量。方法 以Diamonsil C18柱（200mm×4.6mm，5μm）為色譜柱，流動相為乙腈－4mL·L－1磷酸溶液，梯度洗脫，檢測波長為360nm；采用指紋圖譜相似度軟件進(jìn)行相似度評價。結(jié)果 確定了黃蜀葵花的17個共有峰，建立了10批藥材的共有圖譜，并比較了樣品中金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素和槲皮素的含量。結(jié)論 該方法靈敏度高，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確。指紋圖譜信息結(jié)合有效成分含量測定，可較為全面地評價黃蜀葵花的質(zhì)量。

黃蜀葵花；金絲桃苷；異槲皮苷；楊梅素；槲皮素；指紋圖譜

黃蜀葵花為錦葵科植物黃蜀葵Abelmoschus manihot（L.）Medic.的干燥花，其主要功效為清利濕熱、消腫解毒，內(nèi)服用于治療淋濁水腫、濕熱壅遏，外用治療水火燙傷、癰疽腫毒［1－2］。研究表明，黃蜀葵花以黃酮類化合物為主要活性成分，其中以金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素和槲皮素的含量較高［3－4］。本實驗采用HPLC法建立了同時測定黃蜀葵花中黃酮類成分金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素和槲皮素含量的方法［56］，并比較了不同產(chǎn)地黃蜀葵花中黃酮類成分的含量差異；還建立了黃蜀葵花藥材的HPLC指紋圖譜［78］，對不同產(chǎn)地黃蜀葵花藥材指紋圖譜進(jìn)行對比分析，為黃蜀葵花藥材質(zhì)量的全面評價和有效控制提供方法參考和科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC－20AT高效液相色譜儀，包括四元高壓梯度泵系統(tǒng)、紫外檢測器、柱溫控制系統(tǒng)、自動進(jìn)樣系統(tǒng)（日本島津公司）；KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorious BT 25S型十萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 試藥 金絲桃苷對照品（購于成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST－13080201）；異槲皮苷對照品、楊梅素對照品、槲皮素對照品（均購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號分別為120404，121013，121120）。甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；水為液相用水；其他試劑均為分析純。黃蜀葵花藥材，來源于10個不同的產(chǎn)地，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院生藥系劉春生教授鑒定為錦葵科植物黃蜀葵Abelmoschus manihot（L.）Medic.的干燥花冠，10批黃蜀葵花藥材來源及產(chǎn)地見表1。

表1 10批黃蜀葵花藥材來源Tab.1 Resource of Abelmoschus manihot samples

2 方法與結(jié)果

2.1 黃蜀葵花中金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素、槲皮素的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱（200mm ×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈－4mL·L－1磷酸溶液梯度洗脫；流速：1.0mL·min－1；檢測波長：360nm；柱溫：30°C。梯度洗脫條件見表2，色譜圖見圖1。

表2 流動相梯度洗脫程序Tab.2 The mobile phase program of gradient elution

圖1 高效液相色譜圖A.樣品；B.金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素、槲皮素混合對照品；1.金絲桃苷；2.異槲皮苷；3.楊梅素；4.槲皮素Fig.1 HPLC chromatogramsA.sample of Abelmoschus manihot；B.mixed reference substances of hyperfine，isoquercitrin，myricetin and quercetin；1.hyperfine；2.isoquercitrin；3.myricetin；4.quercetin

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取金絲桃苷對照品3.12mg、異槲皮苷對照品3.18mg、槲皮素對照品3.17mg、楊梅素對照品3.28mg，加甲醇超聲溶解，定容至25mL量瓶中，即得各單一對照品溶液。分別從每個量瓶中吸取1mL單標(biāo)母液，置于10mL量瓶中，定容，即得混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱定10個不同產(chǎn)地的黃蜀葵花藥材粉末（過四號篩）各約0.2g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250W，頻率30kHz）30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素、槲皮素對照品儲備液各1mL，分別置于10mL量瓶中，稀釋，定容，分別精密吸取1，2，4，8，10和16μL注入液相色譜儀，測定色譜峰峰面積，以對照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、色譜峰峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表3。

表3 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.3 The results of linear relationship

結(jié)果表明，金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素和槲皮素在線性范圍內(nèi)與峰面積均呈良好的線性關(guān)系。2.1.5 精密度考察 精密吸取同一供試品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定色譜峰峰面積，RSD分別為0.12%，0.21%，0.39%和1.27%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性考察 精密稱取同一批次藥材6份，分別制成供試品溶液，測定峰面積，計算含量。結(jié)果表明，金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素、槲皮素的平均含量分別為1.572%，0.582%，0.078%和0.064%，RSD分別為2.27%，2.20%，2.35%和2.51%，該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在0，2，6，12，24和48h測定峰面積，RSD分別為0.86%，1.01%，1.67%和1.94%，說明樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率考察 精密稱取已知含量的樣品0.2g，精密加入一定量金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素、槲皮素對照品，制成供試品溶液，測定峰面積值，計算加樣回收率。結(jié)果表明，金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素、槲皮素的平均加樣回收率分別為100.98%，103.46%，100.78%和100.24%，RSD分別為0.86%，1.00%，0.47%和1.30%，加樣回收率符合實驗要求。

2.1.9 樣品中金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素、槲皮素含量測定 精密吸取供試品溶液10μL進(jìn)樣，測定峰面積，計算含量，結(jié)果見表4。

表4 不同產(chǎn)地黃蜀葵花中金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素和槲皮素含量Tab.4 The contents of hyperfine，isoquercitrin，myricetin and quercetin of Flos Abelmoschus manihot from different areas

結(jié)果表明，10批黃蜀葵花中金絲桃苷為0.827%～1.529%，異槲皮苷為0.269%～0.743%，楊梅素為0.055%～0.089%，槲皮素為0.035%～0.208%。所有藥材中金絲桃苷均高于0.50%，符合《中國藥典》（2010年版）對黃蜀葵花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。其中河南、云南產(chǎn)地的總黃酮含量較高，安徽、陜西、福建、廣西產(chǎn)地次之；而安徽產(chǎn)地的金絲桃苷含量最高，為1.529%；河南產(chǎn)地的異槲皮苷含量最高，為0.743%；四川產(chǎn)地的楊梅素含量最高，為0.089%；江蘇產(chǎn)地的槲皮素含量最高，為0.208%。說明不同產(chǎn)地的黃蜀葵花中的4種黃酮類成分的含量有差異。通過對不同產(chǎn)地黃蜀葵花藥材中4種黃酮成分的含量測定，為初步評價黃蜀葵花藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。

2.2 黃蜀葵花HPLC指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱（200 mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈－4mL·L－1磷酸溶液梯度洗脫；流速：1.0mL·min－1；檢測波長：360nm；柱溫：30°C。梯度洗脫條件見表5。

表5 流動相梯度洗脫程序Tab.5 The mobile phase program of gradient elution

2.2.2 精密度實驗 取同一供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，檢測指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以金絲桃苷為參照物，計算得相似度均大于90%，17個共有峰相對保留時間RSD為0.01%～0.31%，相對峰面積RSD為0.22%～2.60%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性實驗 取供試品溶液6份，檢測指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以金絲桃苷為參照物，計算得相似度均大于90%，17個共有峰相對保留時間RSD為0.02%～0.62%，相對峰面積RSD為0.47%～2.95%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，分別在0，2，6，12，24和48h進(jìn)樣，檢測指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以金絲桃苷為參照物，計算得相似度均大于90%，17個共有峰相對保留時間RSD為0.02%～0.78%，相對峰面積RSD為0.94%～2.90%，結(jié)果表明樣品在48h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.2.5 指紋圖譜的測定 精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，檢測指紋圖譜。樣品溶液和混合對照品溶液的HPLC圖見圖2。

圖2 HPLC指紋圖譜A.樣品；B.金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素、槲皮素混合對照品；10.金絲桃苷；11.異槲皮苷；15.楊梅素；17.槲皮素Fig.2 HPLC fingerprints chromatogramsA.sample of Abelmoschus manihot；B.mixed reference substance of hyperfine，isoquercitrin，myricetin and quercetin；10.hyperfine；11.isoquercitrin；15.myricetin；17.quercetin

通過比較樣品圖與對照品圖，對樣品圖中的色譜峰進(jìn)行標(biāo)定，樣品圖中保留時間為32.528，34.892，46.291和58.706min處的色譜峰即10，11，15和17號峰分別為金絲桃苷、異槲皮苷、楊梅素、槲皮素對照品的色譜峰。結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)推測，譜圖中14和16號峰可能是槲皮素－3′－O－葡萄糖苷和棉皮素－8－O－β－葡萄糖醛酸苷［9－11］，但還需進(jìn)一步地研究和確定。

2.2.6 指紋圖譜的生成及相似度評價 按上述色譜條件對10批黃蜀葵花藥材進(jìn)行分析檢測，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》，對10批黃蜀葵花藥材的HPLC圖譜進(jìn)行分析，分別進(jìn)行時間窗的設(shè)定、譜峰匹配，共標(biāo)定了17個共有峰，見圖3。指紋圖譜中單峰面積大于或等于5%總峰面積的色譜峰有5個，分別為10，11，12，14和16號峰，其他的峰單峰面積均小于5%。以金絲桃苷色譜峰為參照峰S，對各共有峰的相對保留時間和相對峰面積進(jìn)行統(tǒng)計，17個共有峰相對保留時間RSD為0.03%～0.63%，各產(chǎn)地藥材共有峰保留時間一致。10個不同產(chǎn)地黃蜀葵花藥材的指紋圖譜相似度為90%以上，不同產(chǎn)地藥材圖譜具有很高的相關(guān)性，表明不同產(chǎn)地黃蜀葵花藥材質(zhì)量有較好的相似性。各產(chǎn)地黃蜀葵花藥材相似度見表6。

圖3 10批黃蜀葵花藥材HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints for 10batches samples

表6 10批黃蜀葵花樣品相似度Tab.6 Similarities for 10batches samples

3 討論

本實驗采用HPLC法快速地測定了黃蜀葵花中主要活性成分的含量，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，為進(jìn)一步研究黃蜀葵花藥材中黃酮類成分與藥效的相關(guān)性奠定研究基礎(chǔ)；并通過對10批樣品的分析，初步建立了具有17個共有峰的黃蜀葵花藥材高效液相指紋圖譜，在短時間內(nèi)較好地實現(xiàn)了黃蜀葵花中主要活性成分的分離，操作簡單易行，靈敏度高，為制定該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、研究和開發(fā)利用該藥材資源提供科學(xué)依據(jù)。

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Determination of flavonoids and HPLC fingerprint of Flos Abelmoschus manihot

WANG Yan，WANG Baohua＊，LU Bing，YANG Beibei，LI Ping，MENG Qingqing，JI Wenqin（School of Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective To establish HPLC fingerprint of Flos Abelmoschus manihot and to determine the content of hyperfine，isoquercitrin，myricetin and quercetin.Method Separation was performed on a Diamonsil C18（200mm×4.6mm，5μm）chromatographic column，acetonitrile－4mL·L－1phosphoric acid as the mobile phase with gradient elution.The detection wavelength was at 360nm and the data was processed on the similarity of fingerprint software.Result 17common peaks in chromatograms were separated from 10batches samples.The common pattern was established，and the comparison of hyperfine，isoquercitrin，myricetin and quercetin in the samples was made.Conclusion The method is sensitive，repeatable and accurate.Fingerprint of the effective constituents could be used to control the quality of Flos Abelmoschus manihot availably.

Flos Abelmoschus manihot；hyperfine；isoquercitrin；myricetin；quercetin；fingerprint

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.005

R284

A

1004－2407（2015）04－0345－05

2015－03－10）

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥復(fù)方制藥研究創(chuàng)新團(tuán)隊項目

王妍，女，在讀碩士研究生

＊通信作者：王寶華，女，教授，碩士生導(dǎo)師