■劉雯雯 張海峰 朱清冊(cè) 黃盛東 張 燕 蔡 龍 王志博

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319；2.陽光農(nóng)業(yè)相互保險(xiǎn)公司大慶中心支公司，黑龍江大慶163001）

用于調(diào)控瘤胃發(fā)酵的飼料添加劑，如抗生素，已經(jīng)被證實(shí)是一種改善反芻動(dòng)物生產(chǎn)效率的有效方式。研究證明抗生素作為飼料添加劑可以減少日糧的能量和氮的損失[1]。然而，抗生素在牛奶和肉中殘留的潛在危害性一直受到人們的關(guān)注。從2006年開始?xì)W盟已經(jīng)完全禁止在牲畜飼料中使用抗生素作為添加劑。出于此原因，近些年潛在的天然抗菌素的使用，如植物提取物已經(jīng)被廣泛評(píng)價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)植物提取物能夠改善瘤胃發(fā)酵[2-3]。

蒲公英廣泛分布于東北半球的溫帶。其被用于治療乳房、子宮和肺腫瘤，同時(shí)也可以用于治療肝炎和消化系統(tǒng)疾病[4]。在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中，其也被作為一種無毒的藥草，具有特別的藥用價(jià)值，如療腫、利尿、治療風(fēng)濕病和消炎的作用。其含有許多次級(jí)植物代謝產(chǎn)物，包括皂苷、類黃酮、生物堿類、酚類化合物和類固醇等復(fù)雜的混合物[5]。研究表明，蒲公英乙醇提取物對(duì)葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和蠟狀芽孢桿菌具有抗菌活性[6]。在體外研究中，蒲公英根可以影響瘤胃發(fā)酵[7-8]。然而，關(guān)于蒲公英烘干提取物調(diào)控瘤胃發(fā)酵以改善反芻動(dòng)物的營養(yǎng)利用的潛在性作用的研究很少。因此本研究評(píng)價(jià)了蒲公英提取物對(duì)體外瘤胃發(fā)酵和原蟲數(shù)量的影響。

1 材料與方法

1.1 植物材料和提取物的制備

蒲公英在當(dāng)?shù)匾粋€(gè)中藥商購買。在本試驗(yàn)中，以水或者乙醇作為蒲公英的提取溶劑。水提取物包括冷水提取物（CAE）和水煎煮提取物(BAE)。乙醇提取物包括30%乙醇提取物(TEE)和70%乙醇提取物(SEE)。冷水提取物制備方法如下：在室溫下，用無菌的水將粉碎的蒲公英浸泡24 h。過濾混合物以去除蒲公英渣，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濾液，用真空泵的真空干燥濃縮液，所得粉末置于干燥器中4℃儲(chǔ)存。對(duì)于沸水提取物，在室溫下，以無菌的水浸泡蒲公英2 h，然后沸水提取兩次，每次1 h。之后將混合物過濾、濃縮真空干燥，所得粉末干燥器中4℃存儲(chǔ)。乙醇提取物是蒲公英用30%或者70%的乙醇浸泡，收集乙醇浸泡上清液，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，然后將乙醇濃縮物真空泵的干燥，也于4℃條件下貯存于干燥器中。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和發(fā)酵技術(shù)

以3只裝有瘤胃瘺管的羊作為瘤胃液的提供者。以100 ml具有刻度注射器作為體外培養(yǎng)器。根據(jù)Menke等所述方法[9]，注射器中注入30 ml的培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基由10 ml瘤胃液和20 ml緩沖液組成。將粉碎的羊草（50%）、玉米（29.5%）、豆粕（20.5%），以精粗比50∶50的比例混合作為培養(yǎng)基。準(zhǔn)確稱量200 mg培養(yǎng)基置于100 ml的玻璃注射器中。準(zhǔn)確稱量200 mg培養(yǎng)基和5 mg蒲公英提取物(CAE、BAE、TEE和SEE)置于每個(gè)注射器中。每個(gè)采樣點(diǎn)設(shè)置三個(gè)平行，將注射器39℃下進(jìn)行培養(yǎng)。24 h培養(yǎng)結(jié)束后，測定培養(yǎng)物的pH值、氮態(tài)氨、揮發(fā)性脂肪酸和原蟲的數(shù)量。

1.3 體外發(fā)酵的測定

根據(jù)Menke等描述，記錄培養(yǎng)2、4、6、8、10、12、16和24 h后的氣體產(chǎn)生量[10]。培養(yǎng)24 h后，立即用Sartorious（pH-Meter PB-20）酸度計(jì)測定pH值。取2 ml的發(fā)酵液與0.4 ml的250 g/l偏磷酸混合，然后1 000 r/min離心10 min。上層清液置于-20℃保存，用以測定氮態(tài)氨和揮發(fā)性脂肪酸濃度。

根據(jù)Broderick等(1980)的描述的方法，以UV-2401PC分光光度計(jì)測定氮態(tài)氨的濃度[11]。根據(jù)Erwin等(1961)的方法，使用氣相色譜儀測定揮發(fā)性脂肪酸濃度[12]。以O(shè)gimoto等的描述的方法測定纖毛蟲的數(shù)量[13]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以SAS的混合模型對(duì)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)使用分析。P≤0.05為差異顯著，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式來表示。

2 結(jié)果

2.1 蒲公英烘干提取物對(duì)體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量的影響（見圖1）

圖1 蒲公英烘干提取物對(duì)體外培養(yǎng)產(chǎn)氣量的影響

由圖1可知，蒲公英提取物的添加顯著提高了體外發(fā)酵的氣體產(chǎn)生量。在培養(yǎng)24 h后，煎煮提取物（BAE）、70%乙醇提取物（SEE）的添加使氣體產(chǎn)量分別增加了16.66%和13.98%。

2.2 蒲公英烘干提取物對(duì)體外培養(yǎng)揮發(fā)性脂肪酸的影響（見表1）

由表1可知，與對(duì)照組相比，添加蒲公英提取物顯著增加了總揮發(fā)性脂肪酸的濃度。與對(duì)照組相比，CAE、BAE、TEE和SEE揮發(fā)性脂肪酸分別增加了15.21%、26.33%、11.16%、22.60%。BAE組顯著增加（P=0.04）了丙酸的摩爾比，傾向于降低（P=0.07）乙酸丙酸之比。BAE組和SEE組顯著降低（P=0.04）了丁酸摩爾比。

2.3 蒲公英烘干提取物對(duì)體外培養(yǎng)pH值、氨態(tài)氮和原蟲數(shù)量的影響（見表2）

由表2可知，在培養(yǎng)24 h后，BAE、TEE和SEE顯著降低pH值。蒲公英提取物對(duì)氮態(tài)氨濃度沒有影響。與對(duì)照組相比，4個(gè)提取物組均提高（P＜0.001）了原蟲的數(shù)量，但這4組提取物之間的原蟲數(shù)量差異不顯著。

3 討論

Menk等（1979）研究表明，200 mg飼料干物質(zhì)的24 h體外發(fā)酵產(chǎn)生的氣體與羊體內(nèi)有機(jī)物質(zhì)消化率高度相關(guān)[9]。本研究中，BAE和SEE的添加增加了24 h的氣體產(chǎn)生量，這表明蒲公英提取物可增加瘤胃有機(jī)物的消化率。本研究未測定氣體二氧化碳、甲烷和氫氣濃度，進(jìn)一步的研究工作需要評(píng)價(jià)蒲公英提取物影響瘤胃氣體成分的含量，例如甲烷和氫氣。

表1 蒲公英烘干提取物對(duì)體外培養(yǎng)24 h揮發(fā)性脂肪酸的影響

表2 蒲公英烘干提取物對(duì)體外培養(yǎng)24 h pH值、氨態(tài)氮和原蟲數(shù)量的影響

揮發(fā)性脂肪酸被視為瘤胃發(fā)酵的重要指數(shù)之一，其代表瘤胃發(fā)酵模式和營養(yǎng)消化的效率。本研究結(jié)果顯示蒲公英提取物的添加增加了揮發(fā)性脂肪酸濃度，這表明蒲公英提取物能夠提高瘤胃內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)消化。BAE組增加了丙酸和丁酸的摩爾比，有降低乙酸丙酸之比的趨勢，這表明BAE能夠改變瘤胃發(fā)酵模式。

除CAE外，添加蒲公英提取物可以降低體外培養(yǎng)液的pH值。這種因蒲公英提取物的添加降低pH值的原因可能是由于揮發(fā)性脂肪酸濃度的增加造成的。蒲公英的莖、根和花含有高濃度的皂苷[5]。因?yàn)樵x細(xì)胞膜的甾醇可與皂苷結(jié)合，所以原生動(dòng)物對(duì)皂苷敏感。本研究中，添加沸水提取物、70%乙醇提取物分別增加了原蟲的數(shù)量，研究表明，幾種瘤胃原蟲可以產(chǎn)生丁酸。本研究中，BAE和SEE可以減少原蟲的數(shù)量，這可能是添加蒲公英提取物減少丁酸的原因。

4 結(jié)論

添加蒲公英提取物能夠影響體外的瘤胃發(fā)酵和促進(jìn)瘤胃原蟲的生長，特別是BAE。