朱云鳳，陳少瑜，郝佳波，2，吳 濤，2

(1．云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明650201;2．云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;國家林業(yè)局開放性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明650201)

思茅松 (Pinus kesiya var．langbianensis)為松科(Pinaceae)松屬 (Pinus)樹種，常綠喬木，通常樹體高達(dá)20～30 m，胸徑60 cm，樹冠廣圓形;樹皮褐色，裂成龜甲狀薄塊片脫落;枝條一年生長兩輪或多輪;主要速生用材樹種之一。是中國亞熱帶西部山地林木的代表類型。思茅松樹干通直，木材紋理好、變形小、出材率高、材質(zhì)優(yōu)良，常用于建筑、造紙、制作家具、制膠合板等。活立木可采取松脂，樹皮可提取栲膠，思茅松產(chǎn)脂量較高，產(chǎn)出的松香和松節(jié)油品質(zhì)好，是云南主要用材和采脂樹種，具有較高的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會價值［1］。目前云南省思茅松的立木蓄積量9 306×104m3，松香年蓄積量為11．5 × 104t［2］。RAPD(random amplified polymorphic DNA，RAPD)是1990年由美國杜邦公司科學(xué)家Williams和加利福尼亞生物研究所的Welsh等發(fā)明的一種分子標(biāo)記技術(shù)［3～5］。近年來RAPD已成功應(yīng)用于植物遺傳分析的各個方面，如遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育研究、目的基因的定位與分子標(biāo)記的輔助育種、品種鑒定、遺傳作圖和DNA指紋圖譜等方面［6～23］。目前思茅松在種源選優(yōu)［24］、同工酶分析［8～9］、產(chǎn)脂優(yōu)樹選優(yōu)［25］等方面研究進(jìn)展顯著，但RAPD標(biāo)記在思茅松的遺傳關(guān)系方面的相關(guān)研究報道甚少，鑒于此，作者以思茅松85個優(yōu)良無性系為研究對象，在以思茅松優(yōu)化RAPD技術(shù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行遺傳多樣性分析，為思茅松標(biāo)記輔助的優(yōu)良無性系鑒定、早期選擇、雜交親本的選配和育種群體的多樣性評價提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料采自云南省西雙版納自治州普文林場內(nèi)的思茅松優(yōu)樹匯集區(qū)。該林場地處北緯22．24°～22．26°，東經(jīng) 101．04°～ 101．06°，海拔 800 ～ 1 354 m，年平均氣溫 20．1℃，年降水量 1 655．3 mm，土壤為赤紅壤。

本次試驗(yàn)共采集122個優(yōu)良無性系中的85個無性系，每個無性系隨機(jī)采集1個單株上木質(zhì)化程度較低的新梢，放入裝有硅膠的自封袋中，標(biāo)號，帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-30℃冰箱保存作為分子標(biāo)記試驗(yàn)的材料備用。這85個優(yōu)良無性系分別來自7個天然居群，它們分別是景東者后、墨江通關(guān)永馬、思茅蔓歇壩和思茅木乃河、景谷縣碧安、普洱一工段、普洱二工段。居群編號、各居群對應(yīng)無性系號、居群所在地以及無性系數(shù)量見表1。

表1 85個優(yōu)良無性系及來源Tab．1 85 Pinus kesiya var．langbianensis superior clones from different provenances

7個居群所在的5個縣分別是普洱市思茅區(qū)、墨江哈尼族自治縣、景谷傣族自治縣和景東彝族自治縣，其中居群1、6來自思茅區(qū)，居群2來自景東縣，居群3、7來自寧洱縣，居群4來自景谷縣，群體5來自墨江縣。

1.2 試驗(yàn)方法

1．2．1 思茅松基因組DNA提取

采用Solarbio試劑盒提取思茅松基因組DNA。

1．2．2 RAPD-PCR 擴(kuò)增及引物篩選

通過初篩和復(fù)篩，從北京奧科鼎盛生物科技有限責(zé)任公司合成的120條引物中篩選出穩(wěn)定性強(qiáng)，多態(tài)性高的引物用于所有樣品的RAPD-PCR擴(kuò)增［26～27］。

20 μL的RAPD反應(yīng)體系含20～60 ngDNA模板1．0 uL，10 μM 引物 1．0 μL，2 × Taq PCR MasterMix 10 μL，無菌 ddH20 8．0 μL。熱反應(yīng)的基本程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s;復(fù)性45 s，溫度從Tm+5℃在10次循環(huán)內(nèi)逐步降至Tm-5℃ (每1次循環(huán)退火溫度降低1℃)，72℃延伸2 min，10個循環(huán);之后Tm℃復(fù)性45 s，72℃延伸2 min，25個循環(huán);最后72℃延伸7 min;4℃保存。

1．2．3 擴(kuò)增結(jié)果電泳及記錄

用篩選出的引物對所有無性系樣本進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，照相，記錄結(jié)果。

1.3 遺傳多樣性及聚類分析

統(tǒng)計產(chǎn)生多態(tài)位點(diǎn)的引物在7個居群中擴(kuò)增的電泳帶總數(shù)與多態(tài)帶的數(shù)目。無性系指紋圖譜中的每一條帶作為一個分子標(biāo)記，同一個位點(diǎn)上以出現(xiàn)條帶記為“1”，不出現(xiàn)為“0”來記錄，將圖譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為0/1數(shù)據(jù)矩陣。采用 POPGENE32和MEGA2軟件計算多態(tài)位點(diǎn)百分率PPB、平均每個位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)Ne、Nei’s基因多樣指數(shù)H和Shannon’s多樣性信息指數(shù)I等多樣性指標(biāo)，以及遺傳距離 (GD)和Nei’s遺傳相似性度 (I)，并構(gòu)建各無性系以及各居群的遺傳關(guān)系UPGMA聚類樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD擴(kuò)增及引物篩選結(jié)果

基于1．2．2的擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序，從120條引物中篩選出的20條穩(wěn)定性強(qiáng)、多態(tài)性高的引物，用于所有樣品的擴(kuò)增。20條引物及擴(kuò)增結(jié)果見表2，引物C13對部分試驗(yàn)材料的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

表2 各引物多態(tài)性位點(diǎn)Tab．2 Each primer polymorphisms(SNPs)

圖1 C13對部分無性系的擴(kuò)增結(jié)果Fig．1 RAPD-PCR based on Primer C13

由于退火溫度是影響RAPD技術(shù)穩(wěn)定性的主要因素的特點(diǎn)，在體系優(yōu)化要特別注意退火溫度的選擇，具體是根據(jù)連續(xù)兩次梯度PCR，進(jìn)行退火溫度的篩選。選擇為連續(xù)兩次PCR擴(kuò)增結(jié)果一致的溫度作為PCR的退火溫度，溫度為37℃。

2.2 7個居群的思茅松種子園的遺傳多樣性

本項(xiàng)研究所收集的7個居群的多態(tài)位點(diǎn)百分率PPB、平均每個位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)Ne、Nei’s基因多樣指數(shù)H和Shannon’s多樣性信息指數(shù)I的結(jié)果見表3。從表3可以看出，7個居群的多態(tài)位點(diǎn)百分率PPB的范圍是22．85% ～73．57%，平均值59．48%;平均每個位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)Ne的范圍是 1．228 6 ～ 1．402 9，平均值 1．350 3;Nei’s基因多樣指數(shù) H 的范圍是0．114 3 ～0．243 3，平均值0．206 3;Shannon’s多樣性信息指數(shù)I的范圍是 0．158 4 ～0．369 4，平均值 0．310 0。其中居群5(墨江通關(guān)永馬，16個無性系)的遺傳多樣性水平最高，PPB、Ne、H、I分別為 73．57%、1．402 9、0．243 3、0．369 4。其次是居群 1(思茅曼歇壩，19個無性系)，PPB、Ne、H、I分別為70．71%、1．361 7、0．221 3、0．339 9。而居群 3(普洱二工段，2個無性系)的遺傳多樣性水平最低，PPB、Ne、H、I分別為 22．85%、1．228 6、0．114 3、0．158 4。其次是居群 4(景谷碧安，13個無性系)，PPB、Ne、H、I分別為 57．14%、1．346 2、0．205 4、0．307 4。

表3 各居群的遺傳多樣性指標(biāo)Tab．3 Genetic diversity index of each population based on RAPD

2.3 7個居群的遺傳關(guān)系及聚類

用POPGENE32軟件對由85個樣本組成的來自7個種源地的居群所有條帶的“0、1”矩陣進(jìn)行分析，得到樣本間的遺傳距離I和Nei’s遺傳一致度D，結(jié)果見表4。

表4 7個居群基于RAPD的Nei’s遺傳一致度和遺傳距離Tab．4 Nei’s genetic identity and genetic distance of 7 populations based on RAPD

由表4可知，這7個居群的遺傳距離范圍是0．030 6～0．150 9。其中遺傳距離最近的是居群5(墨江通關(guān)永馬)，遺傳距離為0．038 5和居群6(思茅木乃河)，遺傳距離為0．030 6。遺傳距離最遠(yuǎn)的則是居群3(普洱二工段)，遺傳距離為0．142 3和居群4(景谷碧安)，遺傳距離為0．150 9。

基于表4中的遺傳距離繪制聚類圖 (圖2)。由圖2可知，來自不同種源地的各居群之間的遺傳關(guān)系及聚類結(jié)果。在遺傳距離約0．08以上，可將7個居群分成3個類群。其中居群3(普洱二工段，2個無性系)為1個類群，居群4(景谷碧安，13個無性系)、居群5(墨江通關(guān)永馬，16個無性系)和居群6(思茅木乃河，9個無性系)組成第2個類群，而居群1(思茅曼歇壩，19個無性系)、居群2(景東者后，13個無性系)和居群7(普洱一工段，13個無性系)則組成第3個類群。

圖2 7個居群的RAPD標(biāo)記的聚類分析樹狀圖Fig．2 Dendrogram of RAPD markers of 7 populations

3 結(jié)論與討論

(1)思茅松種子園收集的優(yōu)良無性系保存了思茅松種質(zhì)資源豐富的遺傳多樣性

85個無性系的多態(tài)位點(diǎn)百分率PPB為87．85%，平均每個位點(diǎn)的有效等位基因數(shù) Ne為1．451 7，Nei’s基因多樣指數(shù) H 為0．274 9，Shannon’s多樣性信息指數(shù)I為0．420 2。數(shù)據(jù)表明思茅松種子園收集的優(yōu)良無性系保存了思茅松種質(zhì)資源豐富的遺傳多樣性。

姜遠(yuǎn)標(biāo)［7］等人曾研究的20個思茅松家系，其多態(tài)位點(diǎn)百分率PPB僅為43．87%，表明該種子園優(yōu)樹匯集區(qū)的85個思茅松無性系的遺傳多樣性遠(yuǎn)高于之前研究的20個家系。姜遠(yuǎn)標(biāo)等人之前研究20個家系與本研究的85個無性系中的20個無性系有相同的母本，且研究中每個家系只采集了1個單株進(jìn)行研究，所以此研究結(jié)果也正好印證了85個思茅松無性系更加豐富的遺傳基礎(chǔ)。

此外，對比其他研究者對松屬其他植物油松(Pinus tabuleaformis)和馬尾松 (P．massoniana)的RAPD標(biāo)記研究，其多態(tài)位點(diǎn)百分率PPB大于其他3位研究者研究的油松和馬尾松;平均每個位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)Ne大于趙飛等研究的油松［20］，但小于萬愛華等研究的馬尾松［18］;Nei’s基因多樣指數(shù)H小于其他3位研究者研究的油松和馬尾松［18～20］;Shannon’s多樣性信息指數(shù) I也小于其他3位研究者研究的油松和馬尾松。總之，這幾項(xiàng)衡量遺傳多樣性的指標(biāo)與其它已研究的松屬植物相比，并未明顯小于其他松屬植物的這些遺傳多樣性指標(biāo)，因此可以說，思茅松種子園內(nèi)優(yōu)樹匯集區(qū)的85個無性系與其他省份的油松種子園、油松天然居群和馬尾松種子園的的遺傳多樣性相當(dāng)。此外，來自3個種源地的油松［19］以及來自8個種源地的馬尾松［18］，特別是來自4個省的12個天然居群的油松［20］，其研究者都得出了遺傳多樣系豐富的結(jié)論，而它們的遺傳多樣性指標(biāo)并未高于本研究的85個思茅松無性系，因此，云南省林業(yè)科學(xué)院普文試驗(yàn)林場思茅松種子園收集的優(yōu)良無性系保存了思茅松豐富的遺傳多樣性，為其進(jìn)一步遺傳改良提供了基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，7個居群的遺傳多樣性水平從高到低排列依次是居群5＞居群1＞居群7＞居群2＞居群6＞居群4＞居群3。從這個排列次序也可看出各居群對整體遺傳多樣性的貢獻(xiàn)程度。而各居群遺傳多樣性的大小與選優(yōu)母本所在的天然居群大小、分布、選擇優(yōu)樹的數(shù)量及分子標(biāo)記分析的無性系數(shù)量等因素有關(guān)，此結(jié)果可以為今后試驗(yàn)對象的選擇提供依據(jù)。居群3在本次試驗(yàn)中因客觀條件的限制，取樣過少，導(dǎo)致居群3的遺傳多樣性參數(shù)偏低。

(2)基于RAPD分子標(biāo)記的遺傳距離及聚類分析為思茅松雜交群體的選擇提供參考

由圖2的結(jié)果可以看出各居群之間的遺傳關(guān)系，并將7個居群分為遺傳差異較明顯的3大類群，居群3相對其他居群的遺傳距離最大。而居群4、居群5和居群6之間的遺傳距離較小，可歸為一類;居群1、居群7和居群2之間的遺傳變異也較小，可歸為另一類;而這兩類居群之間的遺傳變異則相對較大。此結(jié)果可為雜交群體的選擇提供分子水平上的依據(jù)。

依據(jù)此關(guān)系可以為育種時雜交親本的選配提供參考。例如，當(dāng)根據(jù)需要選擇居群3內(nèi)的各無性系作為雜交的父本材料時，由圖2就可以看出居群3內(nèi)的各無性系與其它各無性系的遺傳關(guān)系，根據(jù)遠(yuǎn)交優(yōu)勢的原理，在選擇與之雜交的母本時，就應(yīng)該選擇與居群3內(nèi)各無性系遺傳距離盡可能遠(yuǎn)的無性系，這樣雜交之后得到優(yōu)秀子代的可能性將會更大。

此外，臨近的兩個縣之間的距離最多不超過100 km。思茅松屬風(fēng)媒傳粉植物，其傳粉距離較遠(yuǎn)，居群之間應(yīng)存在一定程度的基因交流。將各居群的遺傳距離和聚類圖與7個居群所在的5個縣的空間距離相比較發(fā)現(xiàn)，各居群的空間距離和遺傳距離之間并沒有表現(xiàn)出明顯的相關(guān)關(guān)系，即空間距離遠(yuǎn)的兩個居群，其遺傳距離并不一定大，而空間距離近的兩個居群，其遺傳距離并不一定小。這說明空間距離不是影響這7個居群間遺傳距離的主要因素。其原因與思茅松的繁殖機(jī)制以及各居群所在地的地形、風(fēng)向、動物活動或地理變遷等因素有關(guān)。例如地形的原因，空間距離較近的兩個居群之間若存在山川，它們之間的基因交流就會受到影響，由此兩個居群之間的遺傳距離反而會較遠(yuǎn)。

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