廖紅東，袁珊珊, 楊遠(yuǎn)柱，劉選明,徐 婷, 胡小純，曾夏冬，張 鑫，劉雨晴,朱詠華?

(1.湖南大學(xué) 生物學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙 410082; 2.湖南省亞華種業(yè)研究院, 湖南 長(zhǎng)沙 410116)

一株拮抗稻瘟病內(nèi)生鏈霉菌OsiSh-10的篩選與鑒定*

廖紅東1，袁珊珊1, 楊遠(yuǎn)柱2，劉選明1,徐 婷1, 胡小純2，曾夏冬1，張 鑫1，劉雨晴1,朱詠華1?

(1.湖南大學(xué) 生物學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙 410082; 2.湖南省亞華種業(yè)研究院, 湖南 長(zhǎng)沙 410116)

從湖南瀏陽(yáng)大圍山種植的湘矮早7號(hào)水稻中，篩選到一株對(duì)水稻稻瘟病菌有顯著抑制效果的水稻內(nèi)生放線菌OsiSh-10菌株.由拮抗菌包覆種子和噴曬水稻葉面的實(shí)驗(yàn)表明將該菌噴曬于水稻葉面可以對(duì)葉瘟起到明顯的控制效果，且噴一次的效果比噴兩次的效果好，包覆種子反而使病情指數(shù)升高.根據(jù)形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化、16s rRNA序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建鑒定OsiSh-10菌株屬于白色鏈霉菌(Streptomycesalbus).OsiSh-10是一株具有稻瘟病生防潛力的菌株.

鑒定；內(nèi)生放線菌；稻瘟?。缓Y選；白色鏈霉菌

全世界一半以上的人口以水稻作為主食，尤其是東亞和東南亞地區(qū)[1].許多研究表明，至2030年水稻的產(chǎn)量需提高40%才能養(yǎng)活日益增長(zhǎng)的人口[2].稻瘟病是一種由梨孢霉菌(Magnaportheoryzae)引起的嚴(yán)重危害水稻產(chǎn)量的真菌性病害，能在全世界各個(gè)水稻種植區(qū)廣泛地爆發(fā)[3].每年因稻瘟病的發(fā)生導(dǎo)致全世界的水稻產(chǎn)量降低1%～50%，這些損失價(jià)值7百億美元，可以養(yǎng)活6千萬(wàn)人口[2].利用化學(xué)農(nóng)藥和抗稻瘟病品種仍是稻瘟病防治的普遍措施.長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會(huì)污染環(huán)境，而且其毒性會(huì)損害人類健康，同時(shí)還引起病原菌產(chǎn)生抗藥性；由于受環(huán)境影響及抗病品種單一導(dǎo)致稻瘟病致病性變異而產(chǎn)生新的生理小種，使得抗病品種在3～5年后就喪失抗病性，因此這兩種措施都有了一定的局限性[4].生物防治有高效、廣譜、不污染環(huán)境、不導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)[5].目前利用微生物對(duì)植物病害進(jìn)行防治的生物防治已經(jīng)逐漸引起人們的注意[6].

近來(lái)研究顯示水稻體內(nèi)自身就存在一些具有抑制水稻疾病的內(nèi)生菌[5, 7-8].內(nèi)生菌是一種能夠在植物體內(nèi)生存而不對(duì)寄主植物產(chǎn)生明顯傷害的微生物，是一種天然的微生物活體農(nóng)藥來(lái)源，因其生存在植物體內(nèi)，可以減少田間操作、氣候變化等因素對(duì)其生長(zhǎng)、繁殖和防治效果的影響[9].通過(guò)嚴(yán)格的表面消毒和合適的培養(yǎng)方式，越來(lái)越多的內(nèi)生菌從水稻的根[10-11]、莖[12]、葉[13]中被分離出來(lái)和鑒定.由于放線菌生長(zhǎng)緩慢且分離條件相對(duì)苛刻，目前分離出的內(nèi)生菌大多是細(xì)菌和真菌[14-16]，內(nèi)生菌放線菌分離的報(bào)道較少，尤其是具有抑制稻瘟病菌性能的內(nèi)生放線菌的研究并不多.放線菌是已知產(chǎn)生生物活性物質(zhì)最多的一類微生物[17]，分離并篩選新的拮抗稻瘟病內(nèi)生放線菌具有非常重要的實(shí)際意義.

本文從湖南省瀏陽(yáng)市大圍山種植的湘矮早7號(hào)水稻中分離篩選出一株對(duì)稻瘟病菌有明顯抑制效果的放線菌OsiSh-10菌株，經(jīng)形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征和16S rRNA序列進(jìn)行分析，鑒定為白色鏈霉菌(Streptomycesalblus).這是白色鏈霉(Streptomycesalblus)拮抗稻瘟病的首次報(bào)道，為水稻稻瘟病的生物防治及菌株拮抗作用機(jī)制提供了新的思路.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品及供試菌株

從湖南省瀏陽(yáng)大圍山采取湘矮早7號(hào)水稻；稻瘟病菌生理小種梨孢霉菌62，S07取自于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，梨孢霉菌RB3取自湖南亞華種子有限公司；湘矮早7號(hào)種子取自湖南亞華種子有限公司.

1.1.2 培養(yǎng)基

分離篩選水稻內(nèi)生放線菌的培養(yǎng)基：

1)維他命B腐植酸瓊脂培養(yǎng)基(HV)：腐植酸1 g，磷酸氫二鈉0.25 g，氯化鉀 0.85 g，七水合硫酸鎂0.025 g，七水合硫酸亞鐵0.05 g，碳酸鈣0.01 g，瓊脂粉18 g，Vitamin B 100× 1 mL，純水1 000 mL，pH值7.2 ± 0.2，1×105Pa滅菌25 min.其中腐植酸用0.2 mol/L的氫氧化鈉溶液稀釋溶解后再加入到培養(yǎng)基溶液中；Vitamin B 100×：鹽酸硫胺素5 mg，核黃素5 mg，煙酸5 mg，維生素B6 5 mg，肌醇5 mg，泛酸鈣5 mg，對(duì)氨基苯甲酸25 mg，生物素25 mg，純水100 mL，須經(jīng)過(guò)直徑0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌，在高溫滅菌的HV培養(yǎng)基冷卻至55 ℃左右時(shí)，在無(wú)菌條件下加入1 mL Vitamin B 100×充分混勻后倒板；

2)甘露醇大豆瓊脂培養(yǎng)基(MS)：甘露醇20 g，大豆粉20 g，瓊脂粉20 g，純水1000 mL，pH值7.2 ± 0.2，1×105Pa滅菌25 min.其中大豆粉單獨(dú)滅菌烘干，待培養(yǎng)基冷卻至55 ℃左右時(shí)，在無(wú)菌條件下加入大豆粉充分混勻后倒板；

3)酵母提取物瓊脂培養(yǎng)基(TWYE)：酵母提取物0.25 g，磷酸氫二鉀0.5 g，瓊脂粉18 g，純水1 000 mL，pH值7.2 ± 0.2，1×105Pa滅菌25 min；

4)水瓊脂培養(yǎng)基(WA)：瓊脂粉18 g，純水1 000 mL，pH值7.2 ± 0.2，1×105Pa滅菌25 min；

5)無(wú)機(jī)鹽淀粉培養(yǎng)基(ISP4)：可溶性淀粉10 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鈉1 g，硫酸銨2 g，碳酸鈣2 g，七水硫酸鎂1 g，七水硫酸亞鐵0.001 g，七水氯化錳0.001 g，瓊脂粉18 g，pH值7.2 ± 0.2，1×105Pa滅菌25 min.

用于放線菌的培養(yǎng)及拮抗實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司購(gòu)買的馬鈴薯葡萄糖瓊脂38 g，純水定容至1 000 mL，自然pH，1×105Pa滅菌25 min.

1.2 方 法

1.2.1 放線菌的分離與純化

水稻組織表面消毒分離法.將采集的新鮮水稻上的泥沙用清水洗凈，室溫放置過(guò)夜干燥.將干燥好的水稻分成根、莖、葉和鞘4個(gè)組織，并在超凈工作臺(tái)中對(duì)各組織進(jìn)行表面消毒：浸于124 mmol/L的磷酸氫二鈉緩沖液中超聲1 min，無(wú)水乙醇浸泡1 min，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的次氯酸鈉溶液浸泡6 min，70%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇處理30 s，再用無(wú)菌水清洗樣品30 s后將樣品浸泡于5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的硫代硫酸鈉溶液中5 min，最后用無(wú)菌水清洗5次并置于干凈培養(yǎng)皿中，在超凈臺(tái)里干燥1～3 h.為了驗(yàn)證表面消毒是否徹底，收集水稻表面消毒最后一步中清洗過(guò)水稻的無(wú)菌水，取200 μL均勻涂布于TWYE培養(yǎng)基上放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h左右.若24 h后TWYE培養(yǎng)基上無(wú)任何微生物生長(zhǎng)即說(shuō)明此次表面消毒有效[18].在超凈工作臺(tái)中用剪刀將干燥好的水稻組織樣品剪成1 cm左右長(zhǎng)的小段，再將這些小段置于5種分離培養(yǎng)基上(HV，MS，TWYE，WA和ISP4)，分別在27 ℃及37 ℃的溫度下培養(yǎng)至8周左右.觀察培養(yǎng)皿中放線菌的析出情況，將析出的放線菌挑出轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng).將挑出的內(nèi)生菌在PDA培養(yǎng)基上不斷劃線培養(yǎng)從而獲得該菌的純培養(yǎng)物，用50%甘油儲(chǔ)存放到-80 ℃冰箱中保存，備用.

1.2.2 拮抗放線菌的篩選及抗菌效果測(cè)定

拮抗放線菌的篩選采用平板對(duì)峙法.稻瘟病菌生理小種梨孢霉菌RB3，S07和62在PDA養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d備用，將5 mm梨孢霉菌RB3的菌塊接于直徑90 mm的PDA培養(yǎng)基平板中央，并在距離培養(yǎng)皿中心30 mm的位置上接種活化好的放線菌，每個(gè)處理重復(fù)3次，以不接待測(cè)放線菌為對(duì)照，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10 d后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，測(cè)量真菌菌落邊緣與放線菌之間的距離和真菌菌絲生生抑制率.真菌菌絲生長(zhǎng)抑制率按照下式計(jì)算：真菌菌絲生長(zhǎng)抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組真菌菌絲生長(zhǎng)直徑平均數(shù)/對(duì)照組真菌菌絲生長(zhǎng)直徑平均數(shù))×100%].1.2.3 拮抗菌株大田抗稻瘟病性能的測(cè)定

首先將湘矮早7號(hào)水稻種子進(jìn)行表面消毒[19]，再將消過(guò)毒的種子分別做4種處理.空白組：水稻種子未經(jīng)OsiSh-10菌株處理，置于鋪有兩層濕潤(rùn)濾紙片的培養(yǎng)皿中，再于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中4 d直至發(fā)芽，最后將發(fā)芽的水稻種子播種于大田，并在田間4周播種已經(jīng)感染稻瘟病的發(fā)芽的水稻幼苗；1組：水稻種子用3×107cfu濃度的OsiSh-10孢子液包覆種子，再進(jìn)行如空白組一樣的發(fā)芽和播種；2組：水稻種子進(jìn)行如空白組一樣的處理，但在幼苗生長(zhǎng)的第10 d和第20 d向水稻葉面噴曬濃度為107～108cfu的OsiSh-10孢子液；3組：水稻種子進(jìn)行如空白組一樣的處理，但只在幼苗生長(zhǎng)的第20 d向水稻葉面噴曬濃度為107～108cfu的OsiSh-10孢子液.每個(gè)實(shí)驗(yàn)組做3塊田平行.最后在水稻生長(zhǎng)的30 d觀察各實(shí)驗(yàn)組的發(fā)病情況，從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的每塊田隨機(jī)采集100個(gè)水稻葉片，并按照《稻瘟病檢測(cè)調(diào)查規(guī)范中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》來(lái)統(tǒng)計(jì)記算各組葉片發(fā)病程度和病情指數(shù).發(fā)病程度是感染病斑的面積占整個(gè)葉片面積的百分比.病情指數(shù)的計(jì)算公式：病情指數(shù)=[∑(各級(jí)發(fā)病程度×各級(jí)發(fā)病程度的葉片數(shù))/(最高發(fā)病程度×調(diào)查的總?cè)~片數(shù))]×100%.

1.2.4 拮抗菌株形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特 征的測(cè)定

首先記錄拮抗菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后的菌落形態(tài)特征，并取拮抗菌插片在光學(xué)顯微鏡下觀察氣生菌絲的分支形狀，按照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和ISP法[20]對(duì)拮抗菌株的生理生化特征和不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定.

1.2.5 拮抗菌株DNA提取、16S rRNA基因PCR 擴(kuò)增及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

首先取新鮮的菌液加到滅菌的抽提器中研磨，使菌團(tuán)散開(kāi)，收集磨好的菌液置于1.5 mL eppendorf管中12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心2 min，去上清.用試劑盒中的TE緩沖液重懸菌體，加入0.5 mL體積的玻璃珠，漩渦震蕩2 min，收集液體到干凈的Ep管中.按照上海GENEray公司細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取拮抗菌株的DNA.以所提取的DNA為模板，分別以引物27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，765r:5′-CTGTTTGCTCCCCAC GCTTTC -3′和引物704f:5′-GTAGCGGTG AAATGCCTAGA-3′,492r:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，這兩對(duì)引物擴(kuò)增16S rRNA.PCR反應(yīng)體系(35 μL)：10× buffer 3.5 μL，20 mmol/L濃度的MgCl23.5 μL，一對(duì)10 μmol/L引物共2.8 μL，10 mmol/L dNTP 1.4 μL，2 U/μL Taq酶0.7 μL，ddH2O 22.1 μL，DNA模板 1 μL.PCR反應(yīng)程序?yàn)?30 d循環(huán))：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，72 ℃后延伸10 min.瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物.并將兩段PCR產(chǎn)物送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序以及將所測(cè)得兩段序列拼接為16S rRNA基因序列，再將該拼接后的序列與NCBI上的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 進(jìn)行對(duì)比分析，用Clustalxl1.83軟件和MEGA5.1軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建(鄰接法).

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗稻瘟病菌的放線菌的篩選及抗菌效果測(cè)定結(jié)果

通過(guò)表面消毒結(jié)合5種分離培養(yǎng)基(HV,MS,TWYE,WA和ISP4)的方法從健康的湘矮早7號(hào)水稻中分離出25株水稻內(nèi)生放線菌，用平板對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行篩選，最終獲得一株對(duì)稻瘟病菌有顯著拮抗效果的菌株，編號(hào)為OsiSh-10.該拮抗菌對(duì)3種稻瘟病菌生理小種(RB3，S07，62)的抑制作用如圖1所示．均表現(xiàn)出對(duì)稻瘟病菌有明顯的抑制作用.OsiSh-10菌株對(duì)RB3，S07和62的菌絲生長(zhǎng)抑制率分別是48.15%，40.54%和59.1%，對(duì)RB3，S07和62的抑菌距離分別是15 mm，17 mm和21 mm.

圖1 OsiSh-10菌株對(duì)3種水稻稻瘟病菌生理小種的平板拮抗效果

2.2 OsiSh-10處理后對(duì)大田水稻抗稻瘟病性能的初步分析

大田條件下，OsiSh-10菌株對(duì)30 d稻瘟病葉瘟的防治效果如圖2(a)所示，經(jīng)OsiSh-10菌株孢子液噴曬一次(3組)的水稻葉瘟病情指數(shù)是37.7%，低于空白組水稻葉瘟病情指數(shù)(46.75%)，噴曬二次(2組)的水稻葉瘟病情指數(shù)達(dá)31.01%，顯示OsiSh-10菌株孢子液噴曬對(duì)葉瘟病有較好的控制效果，而且增加噴灑次數(shù)對(duì)葉瘟防治有促進(jìn)作用.然而采用OsiSh-10菌株包覆水稻種子(1組)的水稻葉瘟病情指數(shù)卻為55.73%，高于未經(jīng)處理的空白組水稻葉瘟病情指數(shù).

由水稻根部總內(nèi)生放線菌和OsiSh-10的重分離結(jié)果(圖2(b))可知，經(jīng)OsiSh-10菌株孢子液噴曬一次(3組)的水稻根部總內(nèi)生放線菌分離率0.68%、噴曬二次(2組)的水稻根部總內(nèi)生放線菌分離率0.63%和包覆種子(1組)的水稻根部總內(nèi)生放線菌分離率0.25%菌比空白組(0.18%)大；經(jīng)OsiSh-10菌株孢子液噴曬一次(1組)的水稻根部OsiSh-10分離率0.18%、噴曬二次(2組)的水稻根部OsiSh-10分離率0.2%與包覆種子(3組)的水稻根部OsiSh-10分離率0.19%相差不大，但都比空白組(0.03%)大.結(jié)果顯示接種OsiSh-10菌株會(huì)增加其在根部的數(shù)量，但接種部位(葉面或者根部)對(duì)于其根部的菌株分離率影響不大，接種OsiSh-10菌株后，水稻根部的其他內(nèi)生放線菌的數(shù)量提高，特別是用葉面噴灑方式接種時(shí)，提高尤為顯著，顯示出OsiSh-10對(duì)水稻根部微生態(tài)有明顯影響.

由水稻地上部分總內(nèi)生放線菌和OsiSh-10的重分離結(jié)果(圖2(c))可知，經(jīng)OsiSh-10菌株孢子液噴曬二次的水稻地上部分總內(nèi)生放線菌分離率0.28%、噴曬一次的水稻地上部分部總內(nèi)生放線菌分離率0.25%比空白組(0.16%)大，但包覆種子的水稻地上部分部總內(nèi)生放線菌分離率0.12%比空白組??；在水稻地上部分OsiSh-10分離率中，僅經(jīng)OsiSh-10菌株孢子液噴曬二次的分離率0.14%比空白組(0.09%)大，噴曬一次(0.08%)和包覆種子(0.04%)均比空白組小.與根部情況不同，OsiSh-10菌株接種并不普遍提高其地上部分的菌株分離率，經(jīng)種子包覆接種和僅噴灑一次接種，其OsiSh-10菌株分離數(shù)量反而輕微降低，只有重復(fù)噴灑接種方式才能提高地上部分的OsiSh-10分離率，但是噴灑方式依然能夠提高地上部分分離的內(nèi)生放線菌總量.由病情結(jié)果顯示，噴灑接種OsiSh-10菌株能夠顯著降低稻瘟病病情指數(shù)，分離結(jié)果提示OsiSh-10菌株存在多重抗稻瘟病機(jī)制，除了直接分泌拮抗物質(zhì)之外，對(duì)水稻體內(nèi)微生態(tài)的影響也是一個(gè)重要因素.

處理

處理(b) 30 d后水稻根部總內(nèi)生放線菌和OsiSh-10菌株的分離率

處理(c) 30 d后水稻地上部分總內(nèi)生放線菌和OsiSh-10菌株的分離率

2.3 OsiSh-10菌株的菌落形態(tài)特征、培養(yǎng)特征以及生理生化特征

OsiSh-10菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后菌落呈圓形，干燥多皺、氣生菌絲淡黃色且呈同心環(huán)狀，不產(chǎn)生可溶性色素；在光學(xué)顯微鏡下觀察到OsiSh-10菌株的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲均生長(zhǎng)豐茂，且分枝多；孢子絲為螺旋形(圖3).培養(yǎng)特征實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)表明，OsiSh-10菌株在蔗糖硝酸鹽培養(yǎng)基、葡萄糖天門(mén)冬素培養(yǎng)基和甘油天門(mén)冬素培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較差，在其他培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較良好.在8種培養(yǎng)基上氣生菌絲和基內(nèi)菌絲的顏色及可溶性色素的產(chǎn)生情況基本一致.生理生化及碳源利用試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，OsiSh-10菌株可以在15～40 ℃及pH 5～11范圍內(nèi)生長(zhǎng)，能水解淀粉和酪氨酸，明膠液化，不能水解纖維素，能利用葡糖糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、果糖、半乳糖、甘露醇，很輕微地利用蔗糖和柳醇，不能利用棉子糖和肌醇.根據(jù)形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌手冊(cè)》和文獻(xiàn)[21]描述初步認(rèn)定該菌為白色鏈霉菌.

圖3 OsiSh-10菌株形態(tài)特征

2.4 16S rRNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用兩對(duì)引物通過(guò)PCR方法所克隆出的兩段序列.經(jīng)測(cè)序和拼接，最后得到OsiSh-10菌株的16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為1 359 bp.將OsiSh-10菌株的16S rRNA基因序列在NCBI上通過(guò)BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)OsiSh-10菌株與白色鏈霉菌的遺傳距離最小，且同源性達(dá)99%，16S rRNA基因序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖4.基于16S rRNA序列分析進(jìn)行細(xì)菌鑒定是國(guó)際上通用的分子鑒定技術(shù).16S rRNA序列同源性小于98%，則認(rèn)為種不同；同源性小于93%～95%，則認(rèn)為屬不同[22].綜合OsiSh-10菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列，最終鑒定其為白色鏈霉菌(Streptomycesalblus).

表1 OsiSh-10 菌株的培養(yǎng)特征

Tab. 1 Culture characteristics of OsiSh-10 strain

培養(yǎng)基氣生菌絲基內(nèi)菌絲可溶性色素生長(zhǎng)情況馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)黃白色無(wú)色無(wú)+++蔗糖硝酸鹽培養(yǎng)基白色無(wú)色無(wú)++葡萄糖天門(mén)冬素培養(yǎng)基白色無(wú)色無(wú)+高氏一號(hào)培養(yǎng)基白色無(wú)色無(wú)+酵母麥芽提取物培養(yǎng)基(ISP2)白色無(wú)色無(wú)+++燕麥粉培養(yǎng)基(ISP3)白色無(wú)色無(wú)++無(wú)機(jī)鹽淀粉培養(yǎng)基(ISP4)黃白色無(wú)色無(wú)++甘油天門(mén)冬素培養(yǎng)基(ISP5)白色無(wú)色無(wú)+

注+++:生長(zhǎng)良好; ++，生長(zhǎng)一般; +，生長(zhǎng)差.

表2 OsiSh-10菌株的生理生化特性及碳源利用

Tab. 2 Physiological and biochemical characteristics and use of carbon source of OsiSh-10 strain

碳源試驗(yàn)結(jié)果理化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果D-葡萄糖+生長(zhǎng)溫度/℃15～40D-木糖+生長(zhǎng)pH5～13L-阿拉伯糖+淀粉水解+L-鼠李糖+明膠液化+D-果糖+纖維素分解-D-半乳糖+硝酸鹽還原+D-甘露醇+酪氨酸水解+D-蔗糖±D-柳醇±D-肌醇-D-棉子糖-

注+:陽(yáng)性結(jié)果; ±，很輕微地利用; -，陰性結(jié)果.

圖4 基于16S rRNA基因序列建立的OsiSh-10菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討 論

新型拮抗內(nèi)生放線菌的分離和評(píng)價(jià)是通過(guò)生物防治來(lái)控制和解決稻瘟病的重要研究領(lǐng)域之一，拮抗效果顯著的菌株不僅能夠提高生物防治技術(shù)的實(shí)用性，還對(duì)內(nèi)生菌防治機(jī)理的研究大有裨益.本研究從湖南省大圍山種植的湘矮早7號(hào)水稻地上部分分離出25株內(nèi)生放線菌，從中篩選出一株編號(hào)為OsiSh-10的菌株，該菌株在平板對(duì)持實(shí)驗(yàn)中對(duì)3種水稻稻瘟病菌生理小種均有明顯拮抗效果，這3種生理小種均自感染稻瘟病的水稻內(nèi)直接分離出來(lái)的，由此表明OsiSh-10菌株有較好的稻瘟病生防潛力.初步的田間實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OsiSh-10菌株孢子液噴曬于水稻葉片，可以對(duì)葉瘟起到明顯的控制效果，且噴曬二次的效果比一次的效果好，但是用菌孢子包覆方式接種反而加重病情.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)論采用哪種接種方式，OsiSh-10菌株在水稻根部的分離率基本一致，暗示其在根部的定殖可能受到一定的數(shù)量限制，在根部的過(guò)量接種反而引起植物的應(yīng)急反應(yīng)，使水稻地上部分內(nèi)生放線菌的總量降低，減低了抵抗稻瘟病的能力.內(nèi)生菌主要通過(guò)幾個(gè)方面達(dá)到抗菌作用：產(chǎn)生抗性代謝物殺死或抑制病原菌；激活植物的系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)和誘導(dǎo)抗性(ISR)等免疫反應(yīng)，刺激植物次生代謝的分泌、細(xì)胞程序死亡或促進(jìn)植物生長(zhǎng)等來(lái)提高對(duì)病原菌的抵抗能力；爭(zhēng)奪或影響生態(tài)位來(lái)減緩或者抑制稻瘟病.OsiSh-10菌株分離自水稻葉鞘,直接噴灑顯然有助于增加其在葉片中的定殖量并提高水稻的抗病能力.雖然，明顯的平板拮抗效應(yīng)顯示OsiSh-10可能分泌某種代謝物抑制稻瘟病菌的生長(zhǎng)，但是大田實(shí)驗(yàn)重分離結(jié)果顯示由OsiSh-10介導(dǎo)的微生態(tài)變化可能有更為重要的作用.這有待于對(duì)0siSh-10菌株拮抗代謝物分離鑒定及其拮抗機(jī)制作進(jìn)一步研究.經(jīng)形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征和16S rRNA 序列進(jìn)行分析，鑒定OsiSh-10菌株為白色鏈霉菌，白色鏈霉菌是鏈霉菌的模式種，而其作為拮抗稻瘟病的水稻內(nèi)生菌則是首次報(bào)道，這有利于利用該模式種的豐富研究基礎(chǔ)來(lái)進(jìn)一步探索內(nèi)生放線菌抗稻瘟病的機(jī)理以及田間防治方式.

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Screening and Indentification of an Endophytic Streptomyces to Antagonize Rice Blast

LIAO Hong-dong1, YUAN Shan-shan1, YAN Yuan-zhu2，LIU Xuan-ming1，XU Ting1，HU Xiao-chun2，ZENG Xia-dong1，ZHANG Xin1，LIU Yu-qing1，ZHU Yong-hua1?

(1.College of Biology, Hunan Univ, Changsha,Hunan 410082, China;2.Hunan Yahua Seed Scientific Research Institute, Changsha,Hunan 410116, China)

An endophytic actinomycete strain OsiSh-10 significantly against rice blast pathogens was successfully isolated from Xiangaizao 7 rice (Oryza indica) of Liuyang Dawei Mountain in Hunan Province. The control effects of OsiSh-10 on leaf blast in field were investigated by coating seeds and spraying leaf of rice with it, which were as follows: leaf blast was controlled by spraying OsiSh-10 on leaf of rice , but coated seeds with OsiSh-10 unworked for leaf blast. According to its morphological features, culture characteristics, physiological and biochemical characteristics, 16s rRNA gene sequence comparison, and phylogenetic tree construction analysis, OsiSh-10 strain was classified asStreptomycesalbus. OsiSh-10 strain is a promising biocontrol actinomycete for rice blast.

identification; endophytic actinomycetes; rice blast; screening;streptomyces albus

2015-03-27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51378191),National Natural Science Foundation of China(51378191)；教育部博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(20110161120020)； 湖南省生物發(fā)育工程及新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目(20134486)

廖紅東(1973-)，男，湖南懷化人，湖南大學(xué)副教授，博士

?通訊聯(lián)系人，E-mail:zyh20@hotmail.tom

1674-2974(2015)12-0080-08

Q781

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