李 騰 彭 曦

嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、感染等應(yīng)激狀態(tài)下，由于胃腸道血液灌流障礙發(fā)生早，血供恢復(fù)慢，從而導(dǎo)致腸黏膜屏障功能受損，這也是引發(fā)腸源性感染、腸源性高代謝、全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器官功能不全(MODS)的重要誘因［1］。因此，如何減輕腸道損傷，促進(jìn)腸黏膜修復(fù)已經(jīng)成為目前燒傷治療學(xué)關(guān)注的核心問(wèn)題。腸三葉因子(intestinal trefoil factor，ITF)是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的低分子多肽類物質(zhì)，它能夠維持腸黏膜的完整性，促進(jìn)腸黏膜修復(fù)，但其作用機(jī)制尚未完全清楚［2］。為此，本實(shí)驗(yàn)將采用Transwell 和免疫印跡方法，觀察給予重組ITF(rhITF)后，HT -29 細(xì)胞移行能力和細(xì)胞間黏附分子β -catenin 與E-cadherin 的變化，并探討其促進(jìn)細(xì)胞遷移的可能機(jī)制，為ITF 的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1.細(xì)胞系:人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29 購(gòu)置于中科院細(xì)胞所。

2.主要的藥物與試劑:重組表達(dá)的人腸三葉因子(rhITF)由第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院燒傷研究所提供，1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，小牛血清購(gòu)自?shī)W地利PAA 公司，8μm Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)Corning 公司，β -catenin 抗兔抗體、E-cadherin 抗鼠抗體和磷酸化β -catenin 鼠抗人單抗(Y654)購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗和HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠二抗購(gòu)自北京碧云天公司。

3.細(xì)胞培養(yǎng):結(jié)腸癌HT -29 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%的小牛血清、100U/ml 青霉素和100U/ml 鏈霉素的1640 培養(yǎng)液中。培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，飽和濕度，每隔2 ～3 天傳代1 次，用0.25%的胰蛋白酶消化，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前用倒置顯微鏡觀察，細(xì)胞形態(tài)良好，折光性強(qiáng)。

4.觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法:(1)Transwell 法觀察rhITF 對(duì)HT-29 細(xì)胞移行能力的影響:將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組(1640培養(yǎng)液)，撤掉血清后的不同濃度組:10μg/ml rhITF 組、25μg/ml rhITF 組和50μg/ml rhITF 組。收集對(duì)數(shù)期無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的HT-29 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度5 ×106個(gè)/毫升，取100μl 接種于Transwell 小室的上室。下室中添加600μl 各濃度組別的培養(yǎng)液，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12h 后分別用甲醇固定20min，1g/L 結(jié)晶紫染色15min，清水清洗數(shù)遍后鏡下計(jì)數(shù)，每組取10 個(gè)視野，算均值。(2)Western blot 法觀察rhITF 對(duì)β-catenin、E -cadherin 和磷酸化β -catenin 的蛋白表達(dá)影響:50μg/ml 濃度的rhITF 分別在4、8、12 和24h 處理HT-29 細(xì)胞，用凱基蛋白提取試劑盒進(jìn)行蛋白提取和蛋白濃度檢測(cè)。8% SDS-PAGE 凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，用100ml 含5%脫脂奶粉或者5% BSA 進(jìn)行封閉，β -catenin抗兔抗體(1∶300)、E-cadherin 抗鼠抗體(1∶300)和磷酸化β-catenin 鼠抗人單抗(1∶200)，4℃下孵育過(guò)夜，TBST 洗膜，HRP 標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，ECL 化學(xué)發(fā)光顯影。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:Western blot 法實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Image -Pro Plus 分析蛋白灰度，目的蛋白的灰度=目的蛋白IOD 值/相應(yīng)內(nèi)參IOD 值。計(jì)量資料應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件包分析處理，采用單因素方差分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.rhITF 對(duì)HT -29 細(xì)胞移行能力的影響:通過(guò)穿膜細(xì)胞數(shù)的改變檢測(cè)rhITF 對(duì)HT-29 細(xì)胞移行能力的影響。50μg/ml rhITF 組的細(xì)胞數(shù)顯著多于陰性對(duì)照組、10μg/ml rhITF 組和25μg/ml rhITF 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，25μg/ml rhITF 組與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0. 05)。而10μg/ml rhITF 組與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，圖1、表1)。

圖1 穿過(guò)微孔膜的HT-29 細(xì)胞結(jié)晶紫染色結(jié)果(×200)

表1 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)(±s，n=10)

表1 Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)(±s，n=10)

組別 穿過(guò)Transwell 小室的細(xì)胞數(shù)陰性對(duì)照組113.43 ±4.62 10μg/ml rhITF 組 128.52 ±8.71#25μg/ml rhITF 組 143.10 ±18.54* #50μg/ml rhITF 組 210.64 ±25.73＊＊

2.Western blot 法檢測(cè)β-catenin 和E-cadherin的蛋白含量表達(dá):(1)rhITF 對(duì)β -catenin 蛋白表達(dá)影響:Western blot 法檢測(cè)顯示正常對(duì)照組、4h 組、8h組、12h 組和24h 組，電泳條帶對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量約為95kDa。應(yīng)用Image -Pro Plus 圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析:加入rhITF 后，β-catenin 的蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)，與正常對(duì)照組、4h 組、8h 組和24h 組比較，12h 組β-catenin 的蛋白表達(dá)明顯降低(P ＜0.05)(圖2)。(2)rhITF 對(duì)E -cadherin 的蛋白表達(dá)影響:Western blot 法檢測(cè)顯示正常對(duì)照組、4h 組、8h 組、12h 組和24h 組，電泳條帶對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量約為120kDa。應(yīng)用Image-Pro Plus 圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析:加入rhITF 后，E -cadherin 的蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì)，與正常對(duì)照組、4h 組、8h 組和24h 組比較，12h 組E-cadherin 的蛋白表達(dá)明顯降低(P ＜0.05)(圖3)。(3)rhITF 對(duì)磷酸化β -catenin(Tyr654)的蛋白表達(dá)影響:Western blot 法檢測(cè)顯示各組電泳條帶對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量約為86kDa。應(yīng)用Image -Pro Plus 圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析:加入rhITF 后，與正常對(duì)照組、4h 組、8h 組和24h 組比較，12h 組磷酸化β-catenin(Tyr654)的蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P ＜0.05，圖4)。

圖2 rhITF 對(duì)β-Catenin 蛋白表達(dá)影響

討 論

燒傷后腸黏膜組織修復(fù)和重建是一個(gè)非常復(fù)雜并受多因素影響的過(guò)程，主要由細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞移行共同協(xié)調(diào)完成，其中細(xì)胞移行屬于快速修復(fù)機(jī)制，在腸黏膜早期修復(fù)中起著關(guān)鍵作用［3］。前期研究發(fā)現(xiàn)，與眾多生長(zhǎng)因子相比，ITF 對(duì)腸黏膜修復(fù)具有特異性功能。ITF 是由杯狀細(xì)胞分泌的低分子多肽類物質(zhì)，含有59 個(gè)氨基酸多肽，6 個(gè)半胱氨酸殘基，以3 個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵形成獨(dú)特的“三葉草”結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)的高度保守使之具備抗蛋白酶、抗酸和抗熱分解的生物學(xué)活性［4］。此外，ITF 可以與黏蛋白相互作用形成黏液凝膠層，支持固定腸黏膜，并增強(qiáng)腸黏膜防御損傷的能力［5］。

圖3 rhITF 對(duì)E-cadherin 蛋白表達(dá)影響

圖4 rhITF 對(duì)磷酸化β-catenin(Tyr654)蛋白表達(dá)影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ITF 對(duì)腸黏膜的修復(fù)作用與其促進(jìn)HT-29 細(xì)胞移行有關(guān)。rhITF 能顯著增加細(xì)胞移行能力，通過(guò)改變細(xì)胞形態(tài)，增加穿越微孔的細(xì)胞數(shù)量，并呈現(xiàn)典型的濃度依賴效應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)胞移行。前期的研究結(jié)果也證實(shí)，在黏蛋白的協(xié)同作用下，ITF促進(jìn)細(xì)胞移行的效率大幅度增加［6］。但是ITF 又是如何促進(jìn)細(xì)胞移行，具體的作用機(jī)制是什么，這也是本實(shí)驗(yàn)研究的核心問(wèn)題。細(xì)胞尾部與相鄰細(xì)胞或基質(zhì)的分離是細(xì)胞移行的限速步驟，主要受控于細(xì)胞之間的黏附連接。鈣黏蛋白(E -cadherin)作為一種跨膜糖蛋白，與細(xì)胞內(nèi)的β -連環(huán)蛋白(β -catenin)構(gòu)成E-cadherin/β-catenin 復(fù)合物，并交聯(lián)于胞內(nèi)骨架微絲系統(tǒng)，從而構(gòu)成細(xì)胞之間的主要黏附連接［7］。因此，β -catenin 和E -cadherin 被視為是細(xì)胞移行的主要限制因素，研究ITF 對(duì)二者之間的調(diào)控作用，對(duì)于了解ITF 促細(xì)胞移行的作用機(jī)制具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)Western blot 法檢測(cè)結(jié)果顯示，與其他時(shí)相點(diǎn)組比較，12h 時(shí)β -catenin 和E -cadherin 的蛋白表達(dá)均明顯下降，經(jīng)灰度值分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，rhITF 作用12h 時(shí)通過(guò)抑制β -catenin 和E-cadherin 的蛋白表達(dá)，從而減少E -cadherin/β -catenin 復(fù)合物，降低細(xì)胞之間的黏附，促進(jìn)細(xì)胞遷移。

β -catenin 和E - cadherin 除了參與細(xì)胞間的黏附之外，還調(diào)控多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，由此推測(cè)ITF可能是通過(guò)某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)細(xì)胞移行。酪氨酸激酶受體通路被認(rèn)為是最重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，基本上所有的生長(zhǎng)因子刺激細(xì)胞而產(chǎn)生的信號(hào)都與此通路有關(guān)［8］。生長(zhǎng)因子受體本身具有酪氨酸激酶活性，生長(zhǎng)因子與其受體結(jié)合后，不光使受體自身發(fā)生磷酸化，同時(shí)也使相應(yīng)底物發(fā)生酪氨酸磷酸化，信號(hào)就通過(guò)受體進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)而發(fā)揮作用［9］。相關(guān)研究表明，EGF 和TGF - β1 能夠誘導(dǎo)β -catenin的酪氨酸磷酸化水平上調(diào)［10］。前期研究結(jié)果證實(shí)，在腸上皮細(xì)胞膜上存在與ITF 特異性結(jié)合的受體(ITFR)，ITF 很可能是通過(guò)ITFR 參與眾多的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［11］。Western blot 法檢測(cè)結(jié)果顯示，在rhITF 的刺激下，磷酸化β -catenin 的表達(dá)隨著時(shí)間遞增而加強(qiáng)，12h 時(shí)磷酸化β -catenin 蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。

由此可見，ITF 促進(jìn)細(xì)胞遷移的機(jī)制可能是當(dāng)外源性的ITF 刺激細(xì)胞后，通過(guò)與其受體ITFR 結(jié)合作用后，β-catenin 發(fā)生酪氨酸磷酸化，使E-cadherin/β-catenin 復(fù)合體從肌動(dòng)蛋白絲上解離，導(dǎo)致E -cadherin 介導(dǎo)細(xì)胞間黏附功能喪失，細(xì)胞之間連接松散，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移［12］。ITF 促進(jìn)細(xì)胞移行的分子機(jī)制研究尚處于起始階段，具體的信號(hào)通路及調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

1 Neal MD，Richardson WM，Sodhi CP，et al. Intestinal stemcells and their roles during mucosal injury and repair［J］. J Surg Res，2010，33(1):1 -8

2 Barrera GJ，Sanchez G，Gonzalez，et al. Trefoil factor 3 isolated from human breast milk downregulates cytokines (IL8 and IL6)and promotes human beta defensin (hBD2 and hBD4)expression in intestinal epithelial cells HT-29［J］. Bosn J Basic Med Sci，2012，12(4):256 -264

3 Samson MH，Poulsen SS，et al. Trefoil factor family peptides in the human foetus and at birth［J］. Eur J Clin Invest，2011，41 (7):785 -792

4 Xu CC，Yue L，Wei HJ，et al. Significance of TFF3 protein and Her-2/neu status in patients with gastric adenocarcinoma. ［J］. Pathology Research and Practice，2013，209(8):479 -485

5 Krishnan K，Arnone B，Buchman A. Intestinal growth factors:potential use in the treatment of inflammatory bowel disease and their role in mucosal healing［J］. Inflamm Bowel Dis，2011，17 (1):410 -422

6 王煥，吳修文，萬(wàn)千雪，等. 腸三葉因子和黏蛋白對(duì)燒傷血清所致腸上皮細(xì)胞增殖移行能力變化的影響［J］. 中華燒傷雜志，2011，27(5):347 -352

7 Kadri SR，Lao - Sirieix P，O'Donovan M，et al. Acceptability and accuracy of a non-endoscopic screening test for Barrett's oesophagus in primary care:cohort study［J］. BMJ，2010，341(1):4372 -4376

8 Zheng QQ，Gao J，Li HL，et al.Trefoil factor 3 peptide regulates migration via a Twist-dependent pathway in gastric cell［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications，2013，438(1):6 -12

9 Xu Q，Chen MY，He CY，et al. Promoter polymorphisms in trefoil factor 2 and trefoil factor 3 genes and susceptibility to gastric cancer and atrophic gastritis among Chinese population ［J］. Gene，2013，529(1):104 -112

10 Susumu A，Yasukazu O，Toshiaki G，et al. Tests for serum levels of Trefoil factor family proteins can improve gastric cancer screening［J］. Gastroenterology，2011，141 (3):837 -845

11 Kim CH，Kim D，Ha Y，et al. Expression of mucins and trefoil factor family protein-1 in the colon of pigs naturally infected with salmonella typhimurium［J］. Journal of Comparative Pathology，2009，140(1):38 -42

12 Nikola B，Tatjana B，Mirela BL. Trefoil factor family protein 3(TFF3)is present in cartilage during endochondral ossification in the developing mouse fetus［J］. Acta Histochemica，2013，115(3):204 -208