張曉平 侯 林 李慧芬 田景振

藻膽蛋白是來(lái)自藻類的一種捕光色素蛋白，其主要來(lái)自真核藻類——紅藻、隱藻和原核藻類——藍(lán)藻，某些甲藻也含有藻膽蛋白。藻膽蛋白因其廣泛的作用越來(lái)越受到重視，在抗腫瘤、抗氧化、消炎以及消除體內(nèi)自由基等方面具有很高的活性，藻膽蛋白抗腫瘤功效已經(jīng)有了大量的報(bào)道［1，2］。環(huán)氧化物酶-2(COX-2)在炎癥和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)較高，COX -2抑制劑可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和腫瘤血管的生成，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明，藻膽蛋白能降低腫瘤細(xì)胞前列腺素(PEG2)的水平，使COX -2 的含量降低從而引起細(xì)胞凋亡，通過(guò)選擇性抑制COX-2 活性達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用［3］。

本研究著眼于細(xì)胞水平，利用免疫組化的手段，探討與腫瘤密切相關(guān)的環(huán)氧化酶-2(COX -2)蛋白表達(dá)的關(guān)系，繼而研究了藻膽蛋白抑制腫瘤生長(zhǎng)的方式與途徑，探索新型基因重組藻膽蛋白抗腫瘤作用可能的作用機(jī)制，為新的抗腫瘤海洋藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.材料:(1)動(dòng)物及瘤株:清潔級(jí)昆明小鼠50 只，體重18 ～23g，雄性，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司質(zhì)檢中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供，動(dòng)物合格證編號(hào):SCXK(魯)20080002;小鼠S180 實(shí)體瘤細(xì)胞(上海市細(xì)胞研究所生產(chǎn))，采用常規(guī)方法小鼠體內(nèi)腹腔傳代。(2)藥物和試劑:新型基因重組藻膽蛋白(實(shí)驗(yàn)室自制);藻膽蛋白從螺旋藻中提取(食品級(jí)螺旋藻粉由江蘇賜百年公司生產(chǎn)，純度1.0(A620 / A280);注射用環(huán)磷酰胺(CY，每瓶0.2g，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn));蘇木色精(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司生產(chǎn));30%過(guò)氧化氫(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn));兔抗小鼠COX-2 多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn));SABC 試劑盒包括生物素化山羊抗兔IgG 5%即用型BSA SABC 工作液(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn));DAB 顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn))。(3)儀器:KD-202輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(浙江省金華市科技儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn));生物圖像分析系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技公司生產(chǎn));OLYMPUS-BX50 顯微鏡(日本OLYMPUS 公司生產(chǎn));ZMN -7803 型自動(dòng)組織包埋機(jī)(常州華利電子公司生產(chǎn));Simple PCI 圖像分析系統(tǒng)(V5.2，CompixInc，美國(guó)生產(chǎn))。

2.方法:(1)腫瘤動(dòng)物模型的建立:將凍存的S180 肉瘤細(xì)胞復(fù)蘇活化，并傳代4 代。無(wú)菌抽取S180 肉瘤小鼠腹腔積液，高壓滅菌，稀釋，以0.2 毫升/只在小鼠腋下注射，24h 后隨機(jī)分成5 組:陰性組給予生理鹽水0.5ml 灌胃，新型基因重組藻膽蛋白按50mg/(kg·d)、實(shí)驗(yàn)室制備藻膽蛋白純度1.0(A620/A280)按25、100mg/(kg·d)、進(jìn)口高純度藻膽蛋白純度2.0(A620/A280)25、100mg/(kg·d)灌胃給藥，環(huán)磷酰胺組30mg/(kg·d)腹腔注射，1 次/天，連續(xù)給藥11 天。末次給藥24h 后，處死剝瘤［4］。(2)免疫組化過(guò)程:腫瘤組織固定，病理常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，滴加COX -2 多克隆抗體。載玻片經(jīng)脫蠟、復(fù)水后，3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，檸檬酸鹽微波15min 抗原修復(fù)，PBS 清洗，滴加BSA，37℃孵育20min，甩凈液體，滴加1∶150 的抗體，4℃孵育過(guò)夜，加二抗工作液40 ～50μl，37℃孵育20min，滴加SABC 工作液，37℃孵育20min，加DAB 顯色劑。顯色后蘇木精中復(fù)染，樹(shù)膠封片。(3)COX-2 表達(dá)的檢測(cè):一般腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，認(rèn)為是COX-2 陽(yáng)性染色。選擇5 個(gè)高倍視野，每個(gè)視野分別計(jì)數(shù)約500 個(gè)細(xì)胞，取陽(yáng)性顯色平均數(shù)并評(píng)分，若著色較深定為2 分，著淡色定為1 分，基本上不著色定為0分，著色的細(xì)胞占計(jì)數(shù)的細(xì)胞百分率:≥51%為3 分，26% ～50%為2 分，6% ～25%為1 分，≤5%為0 分，將每張切片染色細(xì)胞的百分率得分染色程度相乘的乘積為其最終得分［5］。COX-2 核周胞質(zhì)薄膜上著色為陽(yáng)性為判定標(biāo)準(zhǔn)。(4)光鏡檢查:免疫組化后切片鏡檢，觀察各腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用Simple PCI 圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析，采用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用F 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

各用藥組小鼠S180 實(shí)體瘤組織中COX-2 表達(dá)與陰性組相比明顯減少(P ＜0.05)。新型基因重組藻膽蛋白組與天然藻藍(lán)蛋白組相比明顯減少(P ＜0.05)，與環(huán)磷酰胺組相比差異不明顯(P ＞0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1。

COX-2 免疫組化主要在核周、胞質(zhì)、胞膜上著色。在顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)，陰性組細(xì)胞核在蘇木精復(fù)染后有一定程度的不規(guī)則現(xiàn)象，陽(yáng)性組細(xì)胞核不規(guī)則程度較輕，新型基因重組藻膽蛋白組、天然藻藍(lán)蛋白組也有一定程度不規(guī)則性。結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 5 組大鼠COX-2 表達(dá)測(cè)定結(jié)果(±s)

表1 5 組大鼠COX-2 表達(dá)測(cè)定結(jié)果(±s)

與陰性組比較，* P ＜0.05;與環(huán)磷酰胺組比較，#P ＜0.05

組別 劑量［mg/(kg·d)］n COX-2 平均陽(yáng)性表達(dá)率(%)- 10 66.12 ±17.20環(huán)磷酰胺組 30 10 26.60 ±7.60*新型基因重組藻膽蛋白組 50 10 28.64 ±4.80* #天然藻膽蛋白(2.0)組 100 10 31.68 ±5.60*天然藻膽蛋白(1.0)組 25 10 42.38 ±18.40陰性組*

圖1 各組免疫組化COX-2 檢查結(jié)果(×400)

討 論

天然藻膽蛋白生物活性廣泛，但以天然藻膽蛋白為對(duì)象進(jìn)行藥物開(kāi)發(fā)存在著許多問(wèn)題，比如成本高、雜質(zhì)多、周期長(zhǎng)。隨著重組DNA 技術(shù)的發(fā)展，胞內(nèi)基因工程產(chǎn)物的數(shù)量不斷增多，新型基因重組藻膽蛋白也可通過(guò)基因工程表達(dá)出來(lái)［6，7］。

環(huán)氧化酶(COX)又稱前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合成酶，是一種膜結(jié)合蛋白，在花生四烯酸合成前列腺素過(guò)程中第1 個(gè)限速酶，是一種雙功酶其結(jié)構(gòu)型酶為COX-1，誘導(dǎo)型酶為COX -2。COX-1 參與細(xì)胞正常生理功能，在多數(shù)細(xì)胞中恒定表達(dá)，而COX-2 在正常狀態(tài)下幾乎不表達(dá)，但在細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、絲裂素、癌基因等的誘導(dǎo)下表達(dá)。COX -2 的表達(dá)屬誘導(dǎo)型，參與多種病理過(guò)程，其表達(dá)定位于核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在正常組織中不表達(dá)，而在惡性腫瘤中表達(dá)較高［8］。

COX-2 在核周、胞質(zhì)、胞膜上著色，陰性組著色最深，平均陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)66.12%。新型基因重組藻膽蛋白組，環(huán)磷酰胺組，天然藻藍(lán)蛋白2.0 組，天然藻藍(lán)蛋白1.0 組與陰性組比較均有不同程度下調(diào)作用。新型重組藻膽蛋白作用的細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞核縮合，且一定濃度的藻藍(lán)蛋白也會(huì)使細(xì)胞表現(xiàn)出DNA濃縮的現(xiàn)象，應(yīng)用藻膽蛋白治療的細(xì)胞在有關(guān)聚合酶斷裂的研究中也有所表現(xiàn)，呈現(xiàn)出一定的裂解模式，藻膽蛋白降低腫瘤細(xì)胞前列腺素(PEG2)的水平，使COX-2 的含量降低從而引起細(xì)胞凋亡，且對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的吞噬細(xì)胞株增殖抑制作用與藻膽蛋白的劑量有關(guān)，呈現(xiàn)劑量依賴性。

新型基因重組藻膽蛋白對(duì)COX -2 的表達(dá)具有一定下調(diào)作用，COX -2 與炎癥過(guò)程密切相關(guān)，COX-2 表達(dá)減少降低了其對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用，從而間接起到抑制腫瘤作用，另外，減少了細(xì)胞的突變及腫瘤細(xì)胞的侵襲力，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。

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2 王庭健，林凡，趙方慶，等.藻膽蛋白及其在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用［J］.植物生理學(xué)通訊，2006，42(2):303 -307

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4 吳蕾，龐廣昌，陳慶森.螺旋藻藻藍(lán)蛋白的規(guī)模化提取和色譜純化技術(shù)研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2008，29(4):461 -463

5 陳智彬，宋永勝.Survivin、Caspase-3、突變型p53 對(duì)膀胱移行細(xì)胞癌預(yù)后的意義［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25(3):348 -350

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7 徐清燕，梁惠，秦松.重組別藻藍(lán)蛋白對(duì)小鼠H22 腫瘤生長(zhǎng)及COX-2 VEGF 和PCNA 表達(dá)的影響［J］. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，46(1):22 -25

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