桂書彥 韓 瑾 葉 強 李 靜 陳立波

近年較多的研究顯示W(wǎng)nt 信號通路在生物的代謝平衡調(diào)節(jié)以及糖尿病等其他代謝相關(guān)疾病中有著重要的影響和作用。2006 年關(guān)于TCF7L2 單核苷酸多態(tài)性與2 型糖尿病發(fā)病易感性研究的新發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)再次激起了Wnt 信號通路與胰島β 細(xì)胞功能及糖代謝調(diào)節(jié)的研究熱潮。

前期，筆者采用小鼠來源的NIT -1 胰島β 細(xì)胞進(jìn)行研究，通過重組蛋白Wnt3a 外源性激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin/TCF 通路，增加了細(xì)胞內(nèi)β -catenin的蛋白水平和下游TCF7L2 的轉(zhuǎn)錄活性，通過調(diào)節(jié)與β 細(xì)胞生長和功能密切相關(guān)的靶基因的表達(dá)實現(xiàn)對β 細(xì)胞的增殖、凋亡和功能的調(diào)節(jié)作用，參與2 型糖尿病的發(fā)病機制。但是，在這些調(diào)節(jié)作用的具體實現(xiàn)中有諸多的分子生物學(xué)機制仍是未知和假想的，有待于進(jìn)一步的研究來探討和證實。在本研究中，筆者擬嘗試通過誘導(dǎo)2 型糖尿病大鼠模型，研究Wnt 信號通路中關(guān)鍵蛋白β -catenin、TCF7L2 的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，了解Wnt 通路與2 型糖尿病大鼠發(fā)病機制的關(guān)聯(lián)。

材料與方法

1.材料:35 只雄性Wistar 大鼠及高脂高糖飼料購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。鏈脲佐菌素(STZ)、牛血清白蛋白(BSA)購自美國Sigma 公司;Western 及IP 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(顯色法)、DAPI、Alexa Fluor 488 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H +L)、Cy3 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H +L)、小鼠抗β -actin 單克隆抗體等相關(guān)試劑購自碧云天生物技術(shù)研究所;兔抗TCF7L2 多克隆抗體、兔抗β-catenin 單克隆抗體購自Abcam 公司。小鼠抗insulin單克隆抗體、兔抗Ki67 多克隆抗體購自武漢谷歌生物科技有限公司。

2.分組及模型建立:雄性Wistar 大鼠35 只，體重200 ～220g，喂養(yǎng)在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院動物實驗中心，自由進(jìn)食、飲水，室內(nèi)溫度20 ～25℃，濕度40% ～50%。隨機分兩組，每組10 只，正常對照組(NC 組)，給予普通飲食，2 組25只，造模實驗組，給予高脂高糖飲食(高脂高糖飼料:其比例為豬油15%，蔗糖20%，蛋黃3%，基礎(chǔ)飼料62%。購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心)。喂養(yǎng)8 周后，實驗組進(jìn)行造模。隔夜禁食12h，實驗組大鼠給予用0.1mmol/L 枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH 4.4)新鮮配制的1%鏈脲佐菌素(STZ)溶液避光冰浴，25mg/kg，腹腔注射，正常對照組大鼠僅注射檸檬酸鈉緩沖液25mg/kg。注射后第6、7 天連續(xù)2 次剪尾測隨機血糖＞16.7mmol/L 即可納入實驗組。

3.取材及標(biāo)本制備:實驗組及對照組大鼠繼續(xù)高脂高糖和普通飲食喂養(yǎng)4 周后，禁食8h，稱重測血糖，10%水合氯醛腹腔注射麻醉處死，立即分離胰腺置液氮保存，留待提取蛋白質(zhì)。部分置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片，制作石蠟切片，用于免疫組化及免疫熒光檢測。

4.免疫熒光檢測胰島TCF7L2、β -catenin 組織表達(dá)及β細(xì)胞的增殖:將石蠟切片脫蠟水化，用檸檬酸抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)后，加入5%BSA 稀釋的抗insulin(1∶100 稀釋)、抗TCF7L2(1∶100 稀釋)、抗β -catenin(1∶200 稀釋)或抗Ki67(1∶200 稀釋)抗體，二抗對照組加入等體積的5% BSA，置于4℃孵育過夜。PBS 洗3 次后，加入Alexa Fluor 488 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H +L)(1∶400 稀釋)和Cy3 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶300 稀釋)混合液，室溫下避光孵育1h。PBS洗3 次，加入終濃度為1μg/ml 的DAPI 溶液，置于室溫避光孵育10min，以復(fù)染細(xì)胞核。用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下觀察拍照，熒光強度用Image Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行分析。

5.免疫組化檢測胰島組織β 細(xì)胞凋亡:按照TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的操作說明書，檢測凋亡細(xì)胞。Insulin 染色方法如上所述，二抗為堿性磷酸酯酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶2000 稀釋)。

6.Western blot 法檢測TCF7L2 及β -catenin 蛋白表達(dá):向凍存的胰腺組織加入適量Western 及IP 裂解液，用勻漿器充分研磨后，將組織勻漿液置于冰上振搖孵育30min，于4℃離心，13000g×10min，吸取上清液，用BCA 法測定蛋白質(zhì)的濃度。每組各取50μg 總蛋白行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，用10%的脫脂奶粉于室溫封閉3h后，分別加入1∶1000 稀釋的兔抗TCF7L2 多克隆抗體、1∶2000稀釋的兔抗β-catenin 單克隆抗體和1∶2000 稀釋的兔抗βactin 單克隆抗體，置于4℃孵育過夜。TBST 洗3 次，分別加入1∶8000 稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(H+L)二抗和1∶5000 稀釋的HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗，室溫下孵育1.5h。用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，并行X 線片曝光。蛋白條帶用凝膠成像系統(tǒng)掃描和進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白與β -actin 條帶的灰度比值表示其相對表達(dá)量。

7.統(tǒng)計學(xué)方法:所有實驗數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用SPSS 17.0 軟件分析。兩組間用獨立t 檢驗，多組間兩兩比較采用單因素方差分析(one -way ANOVA)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

光鏡下觀察正常對照組胰島呈團(tuán)狀，邊界清晰，細(xì)胞核呈橢圓形，胞質(zhì)豐富，胰島數(shù)量及島內(nèi)細(xì)胞數(shù)目較多，高倍鏡/低倍鏡視野中平均10 ～15 個胰島。糖尿病模型組鏡下胰腺組織中胰腺萎縮，胰島數(shù)量減少，體積縮小，視野中平均5 ～8 個胰島(圖1)。

圖1 HE 染色光鏡下觀察胰腺

Wistar 大鼠經(jīng)高脂高糖飲食聯(lián)合小劑量STZ 處理成模后，比較糖尿病模型組體重(BW)低于與對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。糖尿病模型組血糖(BG)顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。免疫熒光通過Ki67 及胰島素雙標(biāo)檢測胰島細(xì)胞增值率9(圖2)。Ki67 染色陽性代表增殖細(xì)胞，insulin 染色陽性代表胰島β 細(xì)胞，鏡下計數(shù)Ki67 + /Insulin+細(xì)胞和Insulin +細(xì)胞比值代表胰島細(xì)胞增殖率。同樣，TUNEL+細(xì)胞與Insulin+細(xì)胞比值代表胰島細(xì)胞的凋亡率(圖3)。DM 組胰島細(xì)胞的增殖率高于NC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);DM 組胰島細(xì)胞凋亡率明顯高于NC 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，詳見表1。

圖2 Ki67 檢測細(xì)胞增殖

圖3 TUNEL 檢測細(xì)胞凋亡

取胰島內(nèi)TCF7L2 相對表達(dá)面積代表胰島組織內(nèi)TCF7L2 表達(dá)水平，結(jié)果顯示DM 組胰島細(xì)胞TCF7L2 表達(dá)顯著高于正常對照組(P ＜0.05);β -catenin 表達(dá)差異不明顯(圖4、圖5)。

Western blot 法檢測糖尿病大鼠模型組TCF7L2蛋白表達(dá)水平高于正常對照組(P ＜0.05)，詳見圖6，與免疫熒光檢測結(jié)果一致。

討 論

迄今為止，眾多研究已經(jīng)證實TCF7L2 與2 型糖尿病之間有著密切的聯(lián)系。2006 年，兩個前驅(qū)研究首次發(fā)現(xiàn)和提出了Wnt/β -catenin 信號調(diào)節(jié)的一個轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2，其基因多態(tài)性與2 型糖尿病發(fā)病風(fēng)險增加密切相關(guān)。并在隨后的不同國家和人種群體中進(jìn)行了大量的遺傳學(xué)研究，均證實了轉(zhuǎn)錄因子TCF7L2 是2 型糖尿病的最強易感基因［1］。但是TCF7L2 的遺傳變異性對2 型糖尿病發(fā)病風(fēng)險的具體影響機制仍然不詳。TCF7L2 在多種組織中表達(dá)，其中包括胰腺，毫無疑問，TCF7L2 可以直接影響胰腺胰島β 細(xì)胞的功能。但是TCF7L2 的轉(zhuǎn)錄與翻譯要受到多種因素包括細(xì)胞內(nèi)各種微環(huán)境影響，同時，它可以通過多種轉(zhuǎn)錄途徑調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，實現(xiàn)對胰島β 細(xì)胞功能及數(shù)量的作用及影響［2］。

表1 模型組與對照組體重、血糖及增殖、凋亡比較(±s)

表1 模型組與對照組體重、血糖及增殖、凋亡比較(±s)

NC.正常對照組;DM.糖尿病大鼠模型組;與NC 組比較，△P ＜0.05，#P ＜0.01

項目 0周8周12周NC DM NC DM NC DM體重(g) 174.10 ±12.00 180.00 ±11.00 232.30 ±3.23 247.80 ±2.47 265.20 ±13.00 249.10 ±16.00血糖(mmol/L) 5.06 ±0.35 5.24 ±0.36 5.05 ±0.43 18.44 ±1.98 5.78 ±0.19# 28.08 ±0.84#凋亡細(xì)胞/islet 1.76 ±0.31△ 7.64 ±0.77△增殖細(xì)胞/islet 0.15 ±0.01△ 0.06 ±0.01△

圖4 免疫熒光檢測TCF7L2 表達(dá):

圖5 免疫熒光檢測β-catenin 表達(dá)

圖6 Western blot 法檢測TCF7L2 及β-catenin 表達(dá)

盡管Wnt 通路及其關(guān)鍵基因TCF7L2 與2 型糖尿病發(fā)病有著密切相關(guān)性已成共識，但是目前研究關(guān)于Wnt 通路及TCF7L2 對胰島的具體作用還存在很多的未知和分歧。細(xì)胞內(nèi)存在著縱橫交錯的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)體系，Wnt 通路可能與胰島素、FOXO 等其他信號通路之間互相影響及作用，實現(xiàn)對體內(nèi)葡萄糖及其他代謝平衡的調(diào)控［3］。同樣，Wnt 信號通路對胰島細(xì)胞的作用也是一個復(fù)雜得過程。筆者在前期的細(xì)胞系研究中發(fā)現(xiàn)，Wnt 不僅可以通過激活下游TCF7L2 的轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)與β 細(xì)胞生長和功能密切相關(guān)的靶基因的表達(dá)，實現(xiàn)對胰島細(xì)胞的直接作用，還可能通過胰島素信號通路中IRS - 2 及其下游PI3K/AKT 通路，間接調(diào)節(jié)胰島β 細(xì)胞增殖、凋亡及胰島素釋放功能［4］。

本研究中，筆者采用傳統(tǒng)的高脂、高糖飲食誘導(dǎo)肥胖及胰島素抵抗大鼠，小劑量STZ 誘導(dǎo)胰島β 細(xì)胞的損傷，使其胰島素分泌功能缺損，構(gòu)建模擬人類2 型糖尿病大鼠模型。糖尿病組大鼠血糖顯著高于正常對照組大鼠。胰腺組織的HE 染色提示胰腺萎縮及胰島的數(shù)量減少。而且通過對兩組大鼠胰腺組織的石蠟切片免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠組中胰島細(xì)胞凋亡增加，增殖減少。同時，筆者采用免疫熒光及Western blot 法檢測了胰腺組織的TCF7L2 及β-catenin 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠的TCF7L2 和β -catenin 的表達(dá)是明顯高于正常對照大鼠的。TCF7L2及β-catenin 是Wnt 信號通路中的關(guān)鍵效用靶基因，TCF7L2 表達(dá)增多提示W(wǎng)nt 通路的激活狀態(tài)，研究結(jié)果提示糖尿病大鼠的Wnt 通路可能是處于激活的，而正常對照大鼠的Wnt 通路處于相對靜息狀態(tài)。Wnt 通路的激活/TCF7L2 的增加是糖尿病發(fā)生的因還是果?TCF7L2 對胰島細(xì)胞究竟是保護(hù)還是損傷作用仍是未知的。早期Schinner 等［5］通過體外分離培養(yǎng)人和小鼠的原代胰島β 細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，抑制TCf7L2 表達(dá)后，胰島β 細(xì)胞的凋亡增加，增殖減少，胰島素分泌減少，相反使TCf7L2 過表達(dá)后，則可以保護(hù)β 細(xì)胞的糖毒性和細(xì)胞因子毒性。體外細(xì)胞實驗顯示TCF7L2 表達(dá)增加，促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖及胰島素釋放，而糖尿病患者或危險基因攜帶者胰島β 細(xì)胞中TCF7L2 表達(dá)是增加的［6］。本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠模型中的TCF7L2 表達(dá)是增加的，結(jié)果提示TCF7L2可能對胰島細(xì)胞有潛在的破壞作用，這個與之前在細(xì)胞系研究中所得出TCF7L2 對胰島細(xì)胞的保護(hù)作用結(jié)論卻是相悖的［6，7］。同樣另外一項研究發(fā)現(xiàn)，在不同的嚙齒類動物的2 型糖尿病模型中，胰島的TCF7L2 的mRNA 水平是升高的，但是蛋白水平卻是降低的［7］。

這些來自不同研究所得出的關(guān)于TCF7L2 在胰島中發(fā)揮有利或有害作用這些看似相互矛盾的結(jié)論，可能與TCF7L2 在同一種細(xì)胞內(nèi)，有不同的表達(dá)形式即剪接體有關(guān)(不同的剪接體，它們轉(zhuǎn)錄的模版是一樣的，但外顯子不太一樣，所以翻譯成蛋白后功能會有差異;還有可以指蛋白的修飾水平不同，比如乙?；揎?、磷酸化修飾等)。最近的一項研究結(jié)果顯示，胰島β 細(xì)胞中不同表達(dá)形式的TCF7L2 會對細(xì)胞的生存、功能和Wnt 激活產(chǎn)生相反的作用［8］。

綜上所述，TCF7L2 可能通過在細(xì)胞內(nèi)形成不同的剪接體選擇性作用于胰島β 細(xì)胞的增殖、凋亡及功能，從而成為胰島細(xì)胞損傷及2 型糖尿病發(fā)生的一個重要因素。但是有關(guān)2 型糖尿病的TCF7L2 風(fēng)險單核苷酸多態(tài)性與TCF7L2 的選擇性剪切之間的重要關(guān)聯(lián)仍有待于開展進(jìn)一步研究。在TCF7L2 的編碼區(qū)、或確定能影響TCF7L2 表達(dá)及可變剪接的區(qū)域內(nèi)，并沒有出現(xiàn)能導(dǎo)致2 型糖尿病的風(fēng)險性單核苷酸多態(tài)性。TCF7L2 對胰島β 細(xì)胞的作用和影響是極其復(fù)雜的，筆者預(yù)測在不久的將來，人們會對胰島及胰腺外組織的TCF7L2 單核苷酸多態(tài)性和其可變剪接之間的關(guān)系會進(jìn)行更深入地探索。通過對不同組織內(nèi)的各種TCF7L2 剪接體正反效應(yīng)的研究，能夠更進(jìn)一步闡明2 型糖尿病的發(fā)病機制，并為糖尿病的治療和預(yù)防提供新的思路。

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