唐紀(jì)蘭 文新年 白 晶

肺癌是發(fā)生率和病死率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。近年來，盡管肺癌的治療有了較大的提高，但是肺癌發(fā)生的分子機(jī)制至今尚不完全明確，因此，進(jìn)一步探索研究新的基因功能改變與肺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，對于進(jìn)一步提高肺癌的治療水平具有重要意義。高爾基磷酸化蛋白3(Golgi protein phosphorylation 3，GOLPH3)屬于高爾基體基質(zhì)蛋白，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種癌基因，主要定位于高爾基體反面的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，通過調(diào)控雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路影響多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞的分化和增殖［1］。關(guān)于GOLPH3 與肺癌組織的關(guān)系研究報道尚少，本研究通過免疫組化法觀察GOLPH3在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)，探討其與惡性腫瘤的內(nèi)在關(guān)系，為尋找新的肺癌預(yù)后標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)提供線索。

材料與方法

1.研究對象:原發(fā)性人肺癌組織標(biāo)本取自筆者醫(yī)院病理科。肺癌病例來自2005 年1 月～2011 年12 月新發(fā)并通過病理學(xué)明確診斷為肺癌。納入標(biāo)準(zhǔn):①患者的臨床病理和隨訪資料完整;②病理明確診斷為非小細(xì)胞肺癌(腺癌或鱗癌);③獲得患者知情同意;④患者手術(shù)前均未進(jìn)行化療或放療，術(shù)后存活時間超過3 個月。排除標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)前接受過化療;②合并其他慢性消耗性疾病或傳染病;③合并其他惡性腫瘤;④樣本量小的其他類型肺癌。隨訪時間為2005 年3月～2012 年12 月，平均隨訪時間為33.9(3 ～70)個月，隨訪率為100%。具有完整的臨床資料且隨訪可靠，并排除并發(fā)其他類型的惡性腫瘤或隨訪中出現(xiàn)非肺癌致死的患者。術(shù)后分期Ⅰ期患者未進(jìn)行輔助化療，Ⅱ～Ⅲ期患者行鉑類為基礎(chǔ)的化療。

2.免疫組化法檢測GOLPH3 在肺癌中的表達(dá)水平:用En-Vision 法常規(guī)進(jìn)行免疫組化檢測GOLPH3 在肺癌組織中的表達(dá)。每張切片隨機(jī)選擇10 個高倍鏡(×400)視野對1000 個細(xì)胞進(jìn)行觀察。GOLPH3 蛋白均主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，為均勻的棕黃色顆粒。GOLPH3 蛋白的表達(dá)為陰性或陽性，按陽性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評判，評判標(biāo)準(zhǔn)為:陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)＜5%為0 分，5% ～24%為1 分，25% ～49%為2 分，50% ～74%為3 分，≥75%為4 分。陽性細(xì)胞表達(dá)的著色深度:基本不著色為0 分，淡黃色為1 分，黃色為2 分，棕黃色3分。兩者得分相乘，0 分記為(-)，1 ～4 分記為(+)，5 ～8 分記為(+ +)，9 ～12 分記為(+ + +)。(+)～(+ + +)視為陽性表達(dá)，其余判定為陰性表達(dá)［2］。

3.統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 15.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對生存概率的估計采用Kaplan-Meier 法，不同組間生存曲線的比較采用Log-rank 檢驗(yàn)，風(fēng)險比(HR)的估計采用COX 比例風(fēng)險模型分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.GOLPH3 蛋白的表達(dá)水平與NSCLC 臨床病理因素的關(guān)系:免疫組化的結(jié)果顯示GOLPH3 蛋白主要定位于NSCLC 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖1)，GOLPH3蛋白的陽性率是66.1%。相應(yīng)的癌旁組織中GOLPH3 蛋白表達(dá)大部分是陰性，GOLPH3 蛋白在癌旁組織中的陽性率是10. 4%。根據(jù)免疫組化的評分標(biāo)準(zhǔn)［2］，GOLPH3 蛋白的表達(dá)水平相應(yīng)的分為陰性表達(dá)和陽性表達(dá)，統(tǒng)計結(jié)果顯示GOLPH3 蛋白的表達(dá)水平與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理類型明顯相關(guān)，而與患者年齡、性別和吸煙史無關(guān)(表1)。

圖1 GOLPH3 蛋白在肺癌組織中表達(dá)(SP，×400)

表1 GOLPH3 的表達(dá)與NSCLC 患者臨床病理分析

2.GOLPH3 蛋白的表達(dá)水平與NSCLC 患者預(yù)后的單因素分析:采用Kaplan - Meier 法，通過Log -rank 檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)GOLPH3 蛋白的表達(dá)水平與NSCLC 患者預(yù)后的關(guān)系(表2，圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GOLPH3 蛋白的表達(dá)水平與肺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，陰性表達(dá)GOLPH3 蛋白的肺癌患者的生存期明顯高于GOLPH3 蛋白陽性表達(dá)者。

表2 COX 回歸單因素分析NSCLC 患者預(yù)后

圖2 Kaplan-Meier 法分析GOLPH3 蛋白的表達(dá)水平與NSCLC 患者總體生存率的關(guān)系

3.GOLPH3 蛋白的表達(dá)水平與NSCLC 患者預(yù)后多因素分析:為了消除各因素之間的交叉相互作用，進(jìn)一步通過多因素COX 回歸分析，結(jié)果顯示GOLPH3 蛋白的表達(dá)水平與NSCLC 患者預(yù)后密切相關(guān)，陽性GOLPH3 表達(dá)的肺癌患者死亡危險增加2.190倍(表3)。這些結(jié)果說明GOLPH3 蛋白的表達(dá)水平是影響NSCLC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。

表3 COX 回歸多因素分析NSCLC 患者預(yù)后

討 論

GOLPH3 基因又稱GPP34、GMx33、MIDAS，編碼一種約34kDa 的蛋白質(zhì)，最初是在對小鼠高爾基體進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析時發(fā)現(xiàn)的，它屬于高爾基體基質(zhì)蛋白，是高爾基體復(fù)合物的一種相關(guān)蛋白，主要發(fā)揮蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的作用［3］。近來研究表明GOLPH3 在非小細(xì)胞性肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤、前列腺癌、胃癌、食管癌和舌癌等多種惡性腫瘤中存在過量表達(dá)，這提示GOLPH3 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，提出GOLPH3 可能是一個全新的致癌基因，是這些腫瘤預(yù)后的一個獨(dú)立危險因素［1，4～8，12～15，19］;關(guān)于GOLPH3 與肺癌組織的關(guān)系僅Scott 等［1］研究報道外，其他報道尚少。

本研究表明，GOLPH3 在NSCLC 組織中表達(dá)明顯增高，并與腫瘤的直徑、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肺癌的病理類型密切相關(guān)，這說明GOLPH3 的表達(dá)與NSCLC 的惡性程度密切相關(guān)，可作為判斷肺癌生物學(xué)特征的輔助指標(biāo)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)GOLPH3 蛋白的表達(dá)水平與肺癌患者的生存期密切相關(guān)，GOLPH3 蛋白表達(dá)陽性的NSCLC 患者生存期明顯低于GOLPH3 蛋白表達(dá)陰性的患者。單因素和多因素分析的結(jié)果均顯示，GOLPH3 蛋白的表達(dá)水平是影響NSCLC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，可以作為預(yù)測NSCLC 患者生存率的有效指標(biāo)。關(guān)于GOLPH3 影響NSCLC 預(yù)后的機(jī)制可能與mTORC 信號通路有關(guān)［1］。mTOR 是一個重要的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，其異?；罨c多種人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［9］。研究表明GOLPH3 可通過mTORCl 和mTORC2 刺激mTOR信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)S6K1、Akt 同時增高，加速蛋白合成、細(xì)胞分裂，抑制細(xì)胞凋亡/程序性死亡［3，4，10］。此外GOLPH3 還可通過與Retromer 復(fù)合體中Vps35 相互作用作用，調(diào)節(jié)Wnt 信號通路的活性［3，11，19］。Wnt 通路的過度激活與多種癌癥(包括結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌等)的發(fā)生緊密相關(guān)［16～18］。癌基因或抑癌基因的突變均可導(dǎo)致正常調(diào)控細(xì)胞增生的調(diào)節(jié)途徑不恰當(dāng)?shù)幕罨?，使?xì)胞增生失控而致腫瘤形成［20］。這些作用可能是GOLPH3 影響肺癌增殖和預(yù)后的機(jī)制。

綜上所述，GOLPH3 在NSCLC 組織中高表達(dá)，可促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖，與患者預(yù)后密切相關(guān)，可能在肺癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮非常重要的作用。GOLPH3 有望為肺癌治療新靶點(diǎn)。本研究因樣本量原因未將小細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌、腺鱗癌、類癌等其他肺癌病理類型納入此次研究，有待于今后進(jìn)一步研究。

1 Scott KL，Kabbarah O，Liang MC，et al. GOLPH3 modulates mTOR signalling and rapamycin sensitivity in cancer［J］. Nature，2009，459(6):1085 -1090

2 邱成志，余外市，王春曉，等. 高爾基磷酸化蛋白3 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系［J］. 中華實(shí)驗(yàn)外科學(xué)雜志，2013，30(8):1746 -1748

3 Scott KL，Chin L. Signaling from the Golgi:mechanisms and models for Golgi phosphoprotein 3 - mediated oncogenesis［J］. Clin Cancer Res，2010，16(8):2229 -2234

4 Zeng Z，Lin H，Zhao X，et al. Overexpression of GOLPH3 promotes proliferation and tumorigenicity in breast cancer via suppression of the FOXO1 transcription factor［J］. Clin Cancer Res，2012，18(8):4059 -4069

5 Ma Y，RenY，Zhang X，et al. High GOLPH3 expression is associated with a more aggressive behavior of epithelial ovarian carcinoma［J］.Virchows Arch，2014，464(4):443 -452

6 Kunigou O，Nagao H，Kawabata N，et al. Role of GOLPH3 and GOLPH3L in the proliferation of human rhabdomyosarcoma［J］. Oncology Reports，2011，26(11):1337 -1342

7 邱成志，余外市，王春曉，等. 高爾基磷酸化蛋白3 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義［J］. 中華實(shí)驗(yàn)外科學(xué)雜志，2013，30(3):461 -463

8 李學(xué)元，劉偉，張學(xué)廣，等. 人腦膠質(zhì)瘤中GOLPH3 的表達(dá)及意義［J］. 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2010，9(9):865 -868

9 Sun SY.mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs［J］. Cancer Letters，2013，340(1):1 -8

10 Abraham RT. GOLPH3 links the Golgi network to mTOR signaling and human cancer［J］. Pigment Cell ＆ Melanoma Research，2009，22(8):378 -379

11 Bugarcic A，Zhe Y，Kerr MC，et al. Vps26A and Vps26B subunits define distinct retromer complexes［J］. Traffic:Copenhagen，Denmark，2011，12(12):1759 -1773

12 Hua X，Yu L，Pan W，et al.Increased expression of Golsi phosphoprotein-3 is associated with tumoraggressiveness and poor prognosis of prostate cancer［J］.Diagn Pathol，2012，7:127

13 Hu BS，Hu H，Zhu CY，et al.Overexpression of GOLPH3 is associated with poor clinical outcome in gastric cancer［J］. Tumour Biol，2013，34:515 -520

14 Wang JH，Chen XT，Wen ZS，et al.Hish expression of GOLPH3 in esophageal squamous cell carcinoma correlates with poor prognosis［J］.PLoS One，2012，7(10):e45622

15 Li H，Guo L，Chen SW，et al.GOLPH3 overexpression correlates with tumor progression and poor prognosis in patients with clinically N0 oral tongue cancer［J］.Transl Med，2012，10(1):168

16 Polakis P. The many ways of Wnt in cancer［J］. Curr Opin Genet Dev，2007，17(1):45 -51

17 Logan CY，Nusse R. The Wnt signaling pathway in development and disease［J］. Annu Rev Cell Dev Biol，2004，20:781 -810

18 Klaus A，Birchmeier W. Wnt signalling and its impact on development and cancer［J］. Nat Rev Cancer，2008，8(5):387 -98

19 周志平，邱成志，余外市，等. 結(jié)直腸癌組織中高爾基磷酸化蛋白3 表達(dá)與Wnt 信號通路的關(guān)系［J］. 中華實(shí)驗(yàn)外科學(xué)雜志，2013，30(12):2709 -2710

20 肖秀英，孫孟紅. Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤的研究進(jìn)展［J］. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2005，21(3):351 -354