董 琳 王志遠 萬春杰 陳兆興 陳小芳

呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼兒下呼吸道感染(LRTI)一種最常見的病原，每年全球大約有60 萬患兒因直接或間接感染RSV 而發(fā)生死亡［1］。生命早期的RSV 感染還與反復(fù)喘息、氣道高反應(yīng)性(AHR)及哮喘密切相關(guān)［2］。雖然這種相關(guān)性的內(nèi)在本質(zhì)尚未明確，但RSV 誘導(dǎo)的炎性介質(zhì)釋放和氣道炎癥持續(xù)存在可能發(fā)揮關(guān)鍵的作用［3］。RSV 能誘導(dǎo)多種趨化因子表達增加，包括單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、巨噬細胞炎性蛋白-1α(MIP -1α)、白介素-8(IL -8)［4，5］。過度的趨化因子表達在RSV 感染的發(fā)病機制中起著重要作用，能夠刺激和募集炎性細胞到感染部位，導(dǎo)致氣道黏液分泌增多、上皮細胞損傷、脫落等炎性反應(yīng)，出現(xiàn)氣道阻塞和氣道高反應(yīng)性［6，7］。因此，阻斷趨化因子的表達和釋放，對治療RSV 感染具有重要價值。活化過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)因具有顯著的免疫調(diào)節(jié)、廣泛的抗炎及抗病毒作用，其在RSV感染治療中的作用令人關(guān)注［8，9］。

本研究采用人氣道上皮細胞A549 細胞系建立RSV 感染的細胞模型，檢測RSV 感染A549 細胞后不同時間MCP-1、MIP -1α 和IL -8 mRNA 表達和蛋白水平，并進一步觀察15d-PGJ2和羅格列酮抑制劑干預(yù)的影響，以闡明RSV 感染時趨化因子的變化及PPARγ 激動劑的抑制作用及機制，為應(yīng)用PPARγ 激動劑治療RSV 感染提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.材料和試劑:人Hep -2 和A549 細胞株購自中科院上海細胞生物研究所，來源于ATCC。RSV-Long 標準株購自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所。15d -PGJ2(美國Biomol 公司)，羅格列酮(北京高盟化工有限公司)，PPARγ 拮抗劑GW9662(上海貝基生物科技有限公司)，PDTC(Sigma 公司)，RNA 引物(Invitrogen 公司)cDNA 第一鏈合成試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，RealMasterMix(北京天根生化科技有限公司)，actin 抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG (碧云天生物技術(shù)研究所)，MCP-1、MIP-1α 及IL-8 ELISA 試劑盒(R＆D 公司)。

2.細胞培養(yǎng):細胞接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，用F12K 培養(yǎng)，置于5%CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱中，待細胞基本長滿后，用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代;每隔2 ～3 天換液，待細胞長至80%融合狀態(tài)時用于實驗。

3.RSV 接種和增殖:將凍存的long 標準株復(fù)蘇后接種于對數(shù)生長期單層Hep -2 細胞上，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱吸附2h 后加入維持液，置溫箱培養(yǎng);逐日觀察細胞病變效應(yīng)(CPE)，待CPE 達75%以上(約2 ～5 天)，收獲病毒懸液置-20℃≥2h、37℃反復(fù)凍融4 次。5000r/min 離心10min，棄沉淀，收集病毒上清液備用，-80℃保存。

4.RSV 半數(shù)感染量(TCID50)測定:Hep -2 細胞以1 ×105/ml 濃度接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100μl。病毒原液用維持液10 倍系列稀釋9 個濃度即10-1，10-2，……，10-9。細胞長成單層時吸棄培養(yǎng)液，PBS 洗3 次，接種各稀釋度的病毒液，每個濃度8 個復(fù)孔，每孔50μl。并設(shè)細胞對照組。置37℃、CO2培養(yǎng)箱中吸附2h，吸棄上清液，每孔加維持液100μl，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。逐日觀察CPE 并記錄，連續(xù)觀察7 天，用Reed-Muench 公式計算病毒的TCID50。

5. 實驗分組:將傳代培養(yǎng)的A549 細胞隨機分為6 組:A組(15d-PGJ2+ RSV 組)、B 組(羅格列酮+ RSV 組)、C 組(RSV 對照組)、D 組(PDTC +RSV 組)、E 組(GW9662 +羅格列酮+ RSV 組)、F 組(細胞對照組)。A 組～E 組均以100TCID50 RSV 吸附2h 后加培養(yǎng)液培養(yǎng)。RSV 吸附前A、B、D 組分別給予15d-PGJ2(20μmol/L)、羅格列酮(20μmol/L)、PDTC(10μmol/L)預(yù)處理0.5h，F(xiàn) 組先以0.01% DMSO 預(yù)處理0.5h，再以不含RSV 的培養(yǎng)液培養(yǎng)。各組分別在培養(yǎng)12、24、48h 收獲細胞及上清液待測。

6.實時定量RT -PCR 檢測MCP -1、MIP -1α 及IL -8表達:收集培養(yǎng)的細胞，Trizol 法提取總RNA，按cDNA 第一鏈合成試劑盒獲得cDNA 模板，置于-20℃保存?zhèn)溆谩ａ槍γ恳恍枰獪y量的基因和管家基因，選擇一確定表達該基因的cDNA 模板進行PCR 反應(yīng)。10mmol/L dNTP mix 1μl，10 × PCR Buffer 2.5μl，50mmol/L MgCl21.5μl，Taq DNA polymerase(5U/μl)0.4μl，擴增引物1(10μmol/L)1μl，擴增引物2(10μmol/L)1μl，cDNA 2μl，補38.1μl 滅菌蒸餾水至總體積為50μl。輕彈管底將溶液混合，設(shè)置PCR 反應(yīng):94℃變性2min;40 個PCR循環(huán)(94℃，20s;60℃，30s;72℃，30s)。MCP -1 上游引物:5' -TATTGTCCACTGACCCC - 3'，下游引物:5' - CTTCACCCAAGTCCTAAGGT - 3';MIP - 1α 上 游 引 物:5' -CTACGTCTCTTGACCAACGT - 3'，下游引物:5' - CACTCCTCACCCAGGTCTTT-3';IL -8 上游引物:5' -TAGCAAAATTGAGGCCAAGG -3'，下游引物:5' - AAACCAAGGCACAGTGGAAC-3';β -actin 上游引物:5' -TGCCCATTTATGAGGGCTAC - 3'，下 游 引 物:5' - GCCATCTCGTTCTCGAAGTC - 3'。PCR 產(chǎn)物與100bp DNA Ladder 在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR 產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。PCR產(chǎn)物進行10 倍梯度稀釋后的DNA 模板以及所有cDNA 樣品分別配置real-time PCR 反應(yīng)體系。體系參照RealMasterMix試劑盒，于real-time PCR 儀上進行PCR 反應(yīng)。監(jiān)測并收集熒光信號。擴增反應(yīng)結(jié)束后建立PCR 產(chǎn)物的熔解曲線。2-△△Ct法計算各標本目的基因的相對表達量。

7.ELISA 檢測MCP -1、MIP -1α 及IL -8 蛋白水平:無菌eppendorf 管收集A549 細胞培養(yǎng)上清液，置-80℃冰箱保存。應(yīng)用ELISA 試劑盒嚴格按照說明書操作。

8.統(tǒng)計學(xué)方法:實驗重復(fù)3 次，計量資料實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(±s)表示。采用SPSS 17.0 軟件進行分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析;兩兩比較方差齊者采用LSD 檢驗，方差不齊者采用Dunnett's-T3 檢驗。

結(jié) 果

1.RSV 感染及PDTC 干預(yù)后MCP -1、MIP -1α、IL-8 mRNA 和蛋白表達的變化:如圖1 及表1 ～表3所示，C 組與F 組相比，MCP-1、MIP-1α、IL-8 mRNA 和蛋白的表達均在12h 開始升高，其中mRNA 表達在24h 達高峰，48h 有所下降，與12h 的表達相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P 均＞0.05);而蛋白的表達在48h 達高峰，與12h 比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P 均＜0.05);D 組各時間點3 種趨化因子mRNA 和蛋白的表達均明顯低于C 組(P 均＜0.05)，但仍高于F 組(P 均＜0.05)。

表1 PPARγ 激動劑干預(yù)對RSV 感染MCP-1 mRNA 及蛋白表達的影響(±s，n=4，pg/ml)

與C 組比較，* P ＜0.05;與F 組比較，#P ＜0.05

組別12h 24h 48h mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白A 組 1859.20 ±36.403* 250.860 ±13.105* 1959.957 ±45.609* 256.193 ±11.670* 1718.690 ±31.309* 269.845 ±11.646*B 組 1881.913 ±69.045* 261.333 ±10.832* 1957.190 ±51.828* 267.232 ±10.625* 1739.836 ±31.319* 277.152 ±10.826*C 組 2427.218 ±59.697# 299.061 ±10.656# 2862.060 ±51.526# 308.134 ±11.321# 2386.833 ±42.969# 367.606 ±11.142#D 組 1869.304 ±33.452* # 262.500 ±10.942* # 2031.330 ±28.600* # 264.515 ±10.813* # 1737.157 ±22.894* # 274.035 ±10.747* #E 組 2305.675 ±63.749# 288.852 ±11.683# 2691.560 ±56.187# 295.366 ±10.382# 2241.673 ±43.550# 339.449 ±13.123#F 組 1035.543 ±22.609* 151.305 ±11.157* 1007.398 ±21.047* 170.697 ±10.181* 1124.348 ±16.476* 149.868 ±13.157*

表2 PPARγ 激動劑干預(yù)對RSV 感染MIP-1α mRNA 及蛋白表達的影響(±s，n=4，pg/ml)

表2 PPARγ 激動劑干預(yù)對RSV 感染MIP-1α mRNA 及蛋白表達的影響(±s，n=4，pg/ml)

與C 組比較，* P ＜0.05;與F 組比較，#P ＜0.05

組別12h 24h 48h mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白A 組 361.117 ±21.036* 333.570 ±11.015* 378.687 ±25.725* 340.954 ±10.850* 343.072 ±18.471* 364.918 ±10.644*B 組 381.583 ±22.436* 379.530 ±10.881* 385.367 ±13.059* 370.202 ±10.577* 367.411 ±17.909* 385.513 ±11.725*C 組 469.296 ±30.146# 410.173 ±11.052# 569.500 ±26.803# 398.223 ±11.624# 471.853 ±30.448# 512.631 ±11.361#D 組 394.196 ±14.146* # 369.595 ±10.770* # 430.910 ±11.651* # 357.454 ±11.045* # 373.933 ±15.041* # 371.655 ±10.710* #E 組 423.410 ±9.070# 395.889 ±11.800# 522.780 ±14.545# 387.303 ±11.082# 433.972 ±26.809# 474.418 ±11.415#F 組 295.679 ±13.679* 90.516 ±8.070* 305.398 ±14.893* 92.013 ±5.400* 323.348 ±16.981* 84.214 ±11.650*

表3 PPARγ 激動劑干預(yù)對RSV 感染IL-8 mRNA 及蛋白表達的影響(±s，n=4，pg/ml)

表3 PPARγ 激動劑干預(yù)對RSV 感染IL-8 mRNA 及蛋白表達的影響(±s，n=4，pg/ml)

與C 組比較，* P ＜0.05;與F 組比較，#P ＜0.05

組別12h 24h 48h mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白A 組 0.411 ±0.001* 2140.106 ±49.12* 0.568 ±0.004* 2219.52 ±85.147* 0.488 ±0.101* 2660.055 ±40.081*B 組 0.460 ±0.001* 2211.201 ±38.328* 0.651 ±0.001* 2313.66 ±67.866* 0.567 ±0.221* 2741.675 ±81.168*C 組 2.420 ±0.016# 3480.152 ±52.218# 2.929 ±0.020# 3528.256 ±88.755# 2.594 ±0.013# 3713.152 ±30.297#D 組 1.926 ±0.013* # 2693.176 ±76.213* # 2.633 ±0.018* # 2914.75 ±99.529* # 2.045 ±0.018* # 3353.182 ±61.493* #E 組 2.280 ±0.014# 3001.620 ±65.341# 2.823 ±0.015# 3111.62 ±59.245# 2.269 ±0.020# 3438.342 ±66.648#F 組 0.635 ±0.201* 2191.746 ±49.17* 0.625 ±0.021* 2218.897 ±41.774* 0.601 ±0.001* 2281.756 ±56.971*

2. PPARγ 激動劑及GW9662 干預(yù)對RSV 感染MCP-1、MIP-1α、IL-8 mRNA 和蛋白表達的影響:如表1 ～表3 所示，A 組、B 組與C 組相比，各時間點MCP-1、MIP -1α、IL -8 mRNA 和蛋白的表達均明顯降低(P 均＜0.05);E 組與C 組相比，各時間點3種趨化因子蛋白及mRNA 的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P 均＞0.05)，但仍高于F 組(P 均＜0.05)。

討 論

氣道上皮細胞是RSV 感染的靶細胞，RSV 在其中復(fù)制能分泌大量的IL-8、MCP-1、MIP-1α 等趨化因子，其中IL-8 屬于CXC 家族成員，對中性粒細胞有強烈的趨化和激活作用;MIP-1α 和MCP-1 屬于CC 趨化因子，可募集中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞到炎癥部位。純化的RSV G 蛋白可以刺激人支氣管上皮細胞IL -8 和MCP -1 的分泌，F(xiàn) 蛋白則促使這些產(chǎn)物向炎癥部位趨化滲出［10］。Seki 等［4］的體外研究發(fā)現(xiàn)，胎兒肺纖維母細胞RSV 感染24h 后，包括IL-8、MCP-1 和MIP-1 在內(nèi)的多種炎性介質(zhì)表達升高，提示趨化因子和細胞因子的過度產(chǎn)生可能與RSV 誘導(dǎo)的過度變態(tài)反應(yīng)性炎癥的病生機制有關(guān)。體內(nèi)研究顯示，RSV 感染后肺部炎性反應(yīng)的程度及病情與鼻咽分泌物、BALF 或肺組織中IL -8、MIP-1α 和MCP-1 水平相關(guān)，表明這些趨化因子在RSV 感染的氣道炎癥中發(fā)揮了重要作用，還可以用來評估病情及指導(dǎo)治療［11～13］。本實驗結(jié)果顯示:RSV 感染后A549 細胞MCP -1、MIP -1α 和IL - 8 mRNA 和蛋白的表達明顯升高，其中基因的表達自感染后12h 開始明顯增加，高峰時間在24h;蛋白的表達則自感染后12h 明顯增加，高峰時間在48h，與文獻報道相一致［10，13］。證實RSV 感染可誘導(dǎo)MCP -1、MIP-1α 和IL- 8 的表達和釋放。

核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)是調(diào)控趨化因子、細胞因子等炎性介質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，激活后可引發(fā)全面的炎性反應(yīng)。PDTC 是是NF-κB 特異性阻斷劑，可抑制NF -κB 的p65 亞單位，并具有金屬螯合作用，通過抑制NF -κB 信號通路，抑制炎性因子基因的表達從而減少其釋放［14］。本研究預(yù)先應(yīng)用PDTC 處理RSV 感染的A549 細胞，結(jié)果能明顯下調(diào)MCP-1、MIP-1α 和IL -8mRNA 表達和蛋白分泌，證明NF-κB 的激活在調(diào)節(jié)趨化因子的表達中有重要作用。抑制NF-κB 信號通路活化，阻斷趨化因子的表達和釋放，可為抑制RSV 誘發(fā)的氣道炎癥、減輕病情提供可靠的治療手段［6，12］。

抑制NF-κB 信號通路激活，下調(diào)細胞因子和趨化因子表達，減少炎性細胞募集是PPARγ 激動劑主要抗炎機制［15］。PPARγ 激動劑可直接與NF - κB p65/p50 結(jié)合，降低NF -κB 與DNA 的結(jié)合活性，也可通過抑制NF - κB 復(fù)合物抑制因子(IκB)激酶(IKKs)活性，減少IκB-α 降解而下調(diào)趨化因子。體內(nèi)外研究顯示15d -PGJ2能抑制IL -8 mRNA 及蛋白水平，延緩IκB-α 降解;而吡格列酮能抑制NF -κB 活性及MCP -1 表達［16］。Arnold 等［17］的研究結(jié)果顯示，15d-PGJ2和羅格列酮干預(yù)對RSV 增殖有顯著的抑制作用，并能有效減少RSV 誘導(dǎo)的細胞因子及合胞體形成，顯著抑制RSV 表面黏附蛋白G 和融合蛋白F 蛋白表達，表明其對RSV 感染兼有抗病毒和抗炎作用。本實驗通過研究15d -PGJ2和羅格列酮對RSV 感染A549 細胞的趨化因子表達水平來探討PPARγ 激動劑的體外抗炎作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15d -PGJ2和羅格列酮干預(yù)均可下調(diào)RSV 感染的MCP -1、MIP-1α 和IL-8 蛋白和mRNA 和表達，而預(yù)先應(yīng)用PPARγ 拮抗劑GW9662 后可以阻斷羅格列酮的上述作用，表明15d-PGJ2和羅格列酮有體外抑制RSV感染MCP-1、MIP-1α 和IL-8 表達的作用，也進一步證實了趨化因子在RSV 誘導(dǎo)的氣道炎癥中的作用。

綜上所述，本研究為PPARγ 激動劑治療RSV 感染的作用及其機制提供了理論證據(jù)，由于PPARγ 激動劑具有多方面的抗炎作用和抗氧化作用，其在RSV感染中是否還可通過非PPAR 依賴的途經(jīng)發(fā)揮作用尚未明確，有待于今后進一步研究。

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