陸 玲 王宇軍 馮偉偉 畢明遠 阮為勇

隨著醫(yī)療水平的提高，早產兒和低出生體重兒存活率增加，新生兒壞死性小腸結腸炎( NEC) 的發(fā)生率呈上升趨勢。近幾年來，國內外專家對NEC 進行了深入的研究，但NEC 的病理機制尚未完全明確，缺乏有效的治療藥物，母乳喂養(yǎng)是目前唯一被證實有效的預防措施［1～3］。Meinzen 等［4］研究證實，母乳喂養(yǎng)降低了超低出生體重兒生后兩周NEC 的發(fā)生率和病死率。盡管專家們已經證實了母乳對NEC 的防治作用，但尚未闡明相關的作用機制［5］。既往研究結果顯示，NEC 發(fā)病與腸上皮細胞缺氧復氧損傷密切相關。因此，本實驗旨在通過建立Caco -2 細胞缺氧復氧損傷模型，研究Caco-2 細胞NF-κB p65 表達及母乳對Caco-2 細胞缺氧、復氧損傷的防治作用，以探討NEC的病理機制和母乳對NEC 的防治作用機制。

材料與方法

1.實驗材料：(1) 細胞與主要試劑：Caco-2 細胞株( 中科院上海細胞庫) ；母乳(2012 年6 月～2013 年6 月江蘇省中西醫(yī)結合醫(yī)院產科正常分娩產婦) ； 人外周學紅細胞裂解液( 中國深圳晶美生物工程有限公司) ； 核因子NF - κB p65 抗體( 美國CST 公司) ；反轉錄試劑盒( 美國MBI Fermentas 公司) ；PCR 引物( 中國上海生物工程技術服務有限公司) 。(2) 主要儀器設備：7500 熒光定量PCR 儀( 美國ABI 公司) ； CentroX3超靈敏微孔板發(fā)光檢測儀( 德國Berthold 公司) ；311 / 3141 細胞培養(yǎng)箱( 美國Thermo Fisher 公司) ，d -63450 生物安全柜( 德國Heal Force 公司) ； ND -1000 核酸蛋白測定儀( 美國Nano Drop 公司) ；ELx 808 酶標儀( 美國Bio-Tek 公司) ；IX51倒置顯微鏡( 日本Olympus 公司) 。

2.實驗方法： ( 1) Caco -2 細胞培養(yǎng)： Caco -2 細胞置于75cm2培養(yǎng)瓶中，采用DMEM 培養(yǎng)基，包含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺和青霉素- 鏈霉素雙抗液，在37℃、5% CO2和90%相對濕度的環(huán)境中培養(yǎng)。每5 天按1∶3的比例傳代，6 ～7 天基本達到融合。(2) Caco-2 細胞缺氧復氧損傷模型的建立［6］：傳代后第6 天生長達到融合的Caco-2細胞，吸去90%的培養(yǎng)液，以減少氣體彌散距離，剩余培養(yǎng)液能維持細胞存活。將其置入密閉容器中，負壓抽吸其中空氣，換入高純氮氣，密閉后置入培養(yǎng)箱中孵育90min( 缺氧) ，再取出，加培養(yǎng)液至原量，置入培養(yǎng)箱中孵育30min( 復氧) 。對照組細胞直接置培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)條件均為37℃、5% CO2和90%相對濕度。(3) 母乳上清液的提?。寒a婦生后2 ～4 天的母乳存于4℃冰箱，在24h 內處理，12000r/min 離心10min去除脂肪成分和細胞碎片，配制成5%的乳清用于實驗；母乳煮沸5 分鐘，12000r/min 離心10min 后配制成5%乳清，兩組乳清均存于-20℃冰箱備用。(4) 實驗分組：實驗分為對照組和缺氧復氧損傷模型組，兩組各有常規(guī)培養(yǎng)液組( MEM) 、未加熱乳清組(5%BM) 和加熱乳清組( 5%BMb) 。造模后向兩組分別加入常規(guī)培養(yǎng)液、未加熱乳清、加熱乳清，繼續(xù)培養(yǎng)6h后分別用RT-PCR 檢測法和免疫熒光法檢測各組細胞中NF-κB p65 表達情況。(5) RT -PCR 檢測法： 根據(jù)試劑盒說明書操作，PCR 引物： GAPDH 引物上游引物：5' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物：5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA - 3'，NF - κB p65 引物上游引物： 5' - AGGCTCCTGTGCGTGTCTCC-3'，下游引物：5' -GGGTGGGCTTGGGGGCAGGT-3'。(6) 免疫熒光法：對數(shù)期生長的細胞接種在24 孔培養(yǎng)板，每孔密度達到70% ～80%。用4%冰多聚甲醛固定細胞20min，PBS 洗15min，0.1% Triton X-100 室溫10min。PBS洗后，用3%BSA 封閉1h，然后一抗4℃孵育過夜，隨后用Texas Red 標記二抗室溫孵育1h。DAPI 染色后封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3.統(tǒng)計學方法：所有實驗重復3 次，采用SPSS 16.0 軟件進行分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(±s) 表示，采用單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.RT - PCR 檢 測Caco -2 細 胞NF - κB p65 mRNA 的相 對 表 達： RT -PCR 檢 測 結 果 顯 示： 模 型MEM 組NF - κB p65 mRNA 的 相 對 表 達 明 顯 高 于對照MEM 組，且差異有統(tǒng)計學意義( P ＜0.01) ，提示缺氧復氧處理后NF - κB p65 mRNA 高度表達；模型組內5%BM 組、5%BMb 組分別與MEM 組比較NF-κB p65 mRNA 表達量明顯降低，對照組內5%BM 組、5%BMb 組分別與MEM 組比較NF -κB p65 mRNA 表達量明顯降低，且差異均有統(tǒng)計學意義( P ＜0.01) ，提示對照組和模型組中，5%乳清和5%加熱乳清均能下調NF -κB p65 mRNA 的表達，說明Caco -2 細胞缺氧復氧損傷前后5% 乳清和5%加熱乳清都能下調NF -κB p65 mRNA 表達； 模型組內5%BM 組NF-κB p65 mRNA 的相對表達低于5%BMb 組，且差異有統(tǒng)計學意義( P ＜0.05) ，對照組內5%BM 組NF-κB p65 mRNA 的相對表達與5%BMb 組相比，，差異無統(tǒng)計學意義( P ＞0.05) ，提示Caco -2 細胞缺氧復氧損傷后5% 乳清下調NF-κB p65 mRNA 表達的作用較5%加熱乳清更明顯( 表1) 。

表1 Caco-2 細胞NF-κB p65 mRNA 的相對表達(±s)

表1 Caco-2 細胞NF-κB p65 mRNA 的相對表達(±s)

與對照MEM 組比較，* P ＜0.01；與模型MEM 組比較，#P ＜0.01；與模型5%BMb 組比較，▲P ＜0.05

組別 NF-κB p65 mRNA的相對表達MEM 1.00 ±0.10對照組 5%BM 0.48 ±0.05*5%BMb 0.45 ±0.08*MEM 2.12 ±0.22*模型組 5%BM 0.63 ±0.07#▲5%BMb 0.97 ±0.25#

2.免疫熒光法檢測Caco-2 細胞中NF-κB p65表達：對照組Caco -2 細胞核內幾乎無紅色熒光，缺氧復氧模型組Caco-2 細胞核內均有紅色熒光，MEM組最明顯，5%BM 最少，說明缺氧復氧刺激后Caco -2 細胞質內的NF -κB p65 被激活進入細胞核表達，5%乳清可以抑制NF -κB p65 入核表達，并且較加熱乳清作用更明顯，這與RT - PCR 檢測結果相符( 圖1) 。

圖1 免疫熒光法檢測Caco-2 細胞中NF-κB p65 表達情況

討 論

新生兒壞死性小腸結腸炎是NICU 中常見的消化道急癥，目前缺乏有效的治療藥物，母乳喂養(yǎng)被眾多專家證實為一種有效的防治手段［7，8］。新鮮母乳中含有多種免疫保護因子和生物活性物質，如免疫球蛋白、乳鐵蛋白、表皮生長因子、轉化生長因子、抗氧化酶、巨噬細胞、淋巴細胞、雙歧因子等，能有效增加早產兒尚未發(fā)育成熟的胃腸道的免疫防御能力，促進腸道黏膜屏障的建立［8］。

NEC 主要表現(xiàn)為腸黏膜的損傷，既往研究顯示，NEC 發(fā)病與腸上皮細胞缺氧復氧損傷密切相關。Caco-2 細胞源于人體結腸腺癌細胞，生長達到融合后有柱狀凸起，向培養(yǎng)液一側形成刷狀緣，類似于小腸微絨毛，且含有與上皮細胞相關的酶系，其結構和功能類似于分化的小腸上皮細胞，能很好的模擬腸道吸收過程，目前已被廣泛用于腸道相關疾病的體外研究以及藥物吸收研究。本研究運用Caco -2 細胞缺氧復氧損傷模擬缺氧致NEC 病理過程，探討母乳對NEC 的作用機制。

NF-κB 信號通路是炎癥研究的熱點，通常情況下NF-κB 以二聚體的形式存在，最普遍的二聚體是p65/p50，其與抑制性蛋白IκB 結合，以無活性的形式存在于細胞質中［9］。當受到某些因素刺激，IκB 磷酸化后迅速降解，NF-κB 二聚體得到釋放，p65 激活后進入細胞核中，促進炎性因子的表達［10，11］。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)缺氧、復氧損傷后Caco-2 細胞中炎性因子IL-1β、IL -6、TNF -α 均明顯表達，母乳能抑制這些炎性因子的表達，其可能是通過抑制NF - κB p65 的表達來實現(xiàn)。

本研究運用RT -PCR 和免疫熒光檢測Caco -2細胞中NF -κB p65 的表達情況，RT -PCR 結果顯示，Caco-2 細胞缺氧、復氧損傷前后5%乳清均能起下調NF -κB p65 mRNA 表達的作用，Caco -2 細胞缺氧復氧損傷后5%乳清下調NF-κB p65 mRNA 表達的作用較5%加熱乳清更明顯；免疫熒光法顯示缺氧復氧刺激后Caco-2 細胞質內的NF-κB p65 被激活進入細胞核表達，5%乳清可以抑制NF - κB p65入核表達，并且較加熱乳清作用更明顯，這與RT -PCR 檢測結果相符，進一步說明母乳能夠抑制NF -κB p65 的表達，這可能是其防治NEC 的一個機制。歐洲兒科胃腸病、肝病和營養(yǎng)學協(xié)會( ESPGHAN) 頒布的文件指出，新鮮的生母母乳是早產兒的第一選擇［12］。本實驗用加熱乳清做對照，證實新鮮母乳中的有效成分在加熱后受影響或者部分受影響，因此新鮮母乳防治NEC 的作用更明顯。

綜上所述，本研究顯示母乳可通過抑制NF -κB p65 的表達減輕缺氧復氧Caco -2 細胞的損傷，尤其是新鮮母乳作用更明顯，為母乳防治NEC 提供一定的理論依據(jù)。因為母乳成分十分復雜，其對NEC 可能存在多重作用機制，需要進一步研究。

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10 Tang T，Zhang J，Yin J，et al.Uncoupling of inflammation and insulin resistance by NF-kappaB in transgenic mice through elevated energy expenditure［J］.J Biol Chem，2010，285(7) ：4637 -4644

11 Gupta SC，Singh R，Pochampally R，et al. Acidosis promotes invasiveness of breast cancer cells through ROS-AKT-NF-κB pathway［J］.Oncotarget，2014，5(23) ：12070 -12082

12 ESPGHAN Committee on Nutrition，Arslanoglu S，Corpeleijn W，et al. Donor human milk for preterm infants： current evidence and research directions［J］. J Pediatr Gastroenterol Nutr，2013，57( 4) ：535 -542