張文斌 唐其柱 李 金 向仕釗 胡哲夫

心肌肥厚是指心臟在長期壓力負荷、心肌梗死、冠狀動脈疾病等因素的刺激下產生的一種泵血功能增強、心室壁張力減弱的適應性改變，是心力衰竭、心律失常及猝死的獨立危險因素，是眾多心血管疾病的共同病理過程［1，2］。小鼠心肌肥厚模型的構建主要有手術和藥物兩種方式，手術方式分為腹主動脈結扎術、升主動脈結扎術和頸總動脈結扎術等，其病死率高且效率低［3］； 藥物主要為皮下泵注血管緊張素Ⅱ等激動劑，使小鼠全身小動脈收縮而引起血壓升高，最終導致心肌肥厚，但血管緊張素Ⅱ等半衰期極短［4］。與其他交感神經遞質相比，ISO 不僅半衰期相對較長，能更真實的模擬自然病程，而且皮下注射ISO 方法也更為簡單、經濟。此外，大鼠皮下注射ISO 誘導心肌肥厚模型的文獻較多，但小鼠的相關文獻較少且方法報道不一致［5］。本研究通過向C57 品系小鼠皮下注射ISO 構建心肌肥厚模型，探討ISO 在對心肌肥厚模型構建的效果及其激活的相關信號通路，尤其是MAPK 家族信號通路的作用［6］。

材料與方法

1.實驗動物及試劑： SPF 級C57 雄性小鼠( 8 周齡，25 ±2g) 的20 只，購自北京華阜康生物科技有限公司，飼養(yǎng)于武漢大學人民醫(yī)院實驗動物中心SPF 級動物室。動物實驗的操作均參照美國《實驗動物管理和使用指南》，且經過武漢大學人民醫(yī)院動物管理和使用中心的批準。ISO( I5627) 購自Sigma公司； 一 抗P - ERK( 4370P) 、T - ERK( 4695) 、P - JNK(4668P) 、T-JNK(9258) 、GAPDH(2118) 均購自CST 公司；二抗：IRDye 800CW 購 自LI - COR Biosciences； PVDF 膜 購 自Millipore 公司；ANP 引物購自上海生物工程股份有限公司，上游引物：5' -ACCTGCTAGACCACCTGGAG-3'；下游引物：5' -CCTTGGCTGTTATCTTCGGTACCGG-3'；TRIzol 來自于Invitrogen 公司；SYBR Green 1Master Mix 試劑盒購自Roche 公司。

2.實驗方法：(1) 心肌肥厚小鼠模型的構建： 將C57 雄性小鼠隨機分為對照組( NS 組) 與模型組( ISO 組) ，每組10 只，于早晚兩次分別皮下注射劑量為5mg/kg 的生理鹽水與ISO，連續(xù)注射2 周。(2) 超聲檢查： 將NS 組與ISO 組小鼠用異氟烷麻醉后剃去頸部及前胸壁的毛，暴露前胸壁，涂抹超聲耦合劑后進行超聲檢查，測得射血分數。(3) 取材：用頸椎脫臼法處死小鼠，固定四肢，由頸部沿左鎖骨中線剪開胸腔，暴露心臟后將心臟完整剪下，擠去心腔內殘余的血液，在分析天平上稱量心臟重量并記錄，隨后一部分小鼠心臟切除心房與右心室，將剩下的左心室裝入凍存管放液氮中保存，最后放入-80℃冰箱冷藏，另一部分心臟生理鹽水沖洗后放入裝有甲醛溶液的尿杯保存；暴露肺后將肺完整剪下，擦去表面血液，在分析天平上稱量肺重量并記錄； 剪開小鼠腿部肌肉測量其脛骨長度并作記錄。(4) 病理切片：取出保存在甲醛溶液中的組織，固定后常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，修整蠟片，切成厚度為5μm 的薄片，染色封片后放到顯微鏡下攝取圖像。NS 組與ISO 組各有4 張切片，每張片隨機拍攝10 個視野，每個視野隨機挑選5 個細胞，即每組統計200 個心肌細胞橫截面積。(5)心肌蛋白的提?。喝?80℃冰箱保存的組織迅速置于干冰上，將樣本放入準備好的EP 管中，放入6 顆小鋼珠，加入裂解液，蓋好EP 管蓋。將EP 管放入研磨儀研磨罐中，隨后將研磨罐安裝在研磨儀上，30 下/秒研磨90s。取出EP 管，倒出鋼珠，4℃離心。將收集下來的細胞殘液用超聲裂解儀裂解，放置15min 后離心，取上清分裝至EP 管。BCA 法定量蛋白質濃度，分裝后-80℃冰箱保存。( 6) 反轉錄- 聚合酶鏈反應( RT-PCR) ：在心肌組織中提取RNA，計算濃度與純度，放入-80℃冰箱保存。然后取出RNA，反轉錄合成cDNA 第1 鏈，產物用于PCR。取PCR 管加入cDNA、上、下游引物、MIX、滅菌去離子水等，離心混勻后進行PCR 反應。產物瓊脂糖凝膠電泳后用紫外分析儀觀察有無特異性擴增帶，并拍照記錄。(7) Western blot 法檢測分析： 等體積蛋白質( 10μl) 經聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS - PAGE) 分離后，轉移到聚偏二氟乙烯( PVDF) 膜上，加入7%脫脂牛奶放搖床上室溫封閉1h 后，用含有Tween-20 的Tris-HCl 緩沖鹽溶液( TBST) 洗滌，加入一抗放入4℃冰箱搖床過夜。取出蛋白膜放入二抗稀釋液中避光孵育1h，孵育結束后用TBST 洗滌，放入熒光檢測儀中檢測。

3. 統計學方法： 應用SPSS 19.0 統計軟件包進行統計分析，計量資料以均數±標準差(±s) 表示，采用配對t -檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.藥物注射后存活率比較： 分別注射ISO 與NS 2 周后，兩組小鼠的存活率均為100%。

2. 超聲結果比較： 注射2 周后，ISO 組小鼠的EF%與NS 組相比有明顯下降，可認為造成了小鼠心臟病理性的改變，差異有統計學意義( 圖1) 。

圖1 NS 組小鼠與ISO 組小鼠射血分數

3.兩組組織重量的比較： 取材稱重后，ISO 組小鼠的HW、HW/BW、LW、LW/BW 比與NS 組相比均增高，差異有統計學意義( 圖2、圖3) 。

圖2 NS 組小鼠與ISO 組小鼠心重/體重比( HW/BW)

4.兩組心肌細胞橫截面積的比較： ISO 組小鼠心肌細胞橫截面積較NS 組有顯著提高，差異有統計學意義( 圖4) 。

5.兩組中心鈉肽( ANP) 的比較：ISO 組小鼠ANP較NS 組有顯著提高，差異有統計學意義( 圖5) 。

6.Western blot 法相關蛋白表達結果：與NS 組相比，ISO 組P-ERK、P -JNK 等MAPK 家族信號通路標志物表達均增強( 圖6) 。

圖3 NS 組小鼠與ISO 組小鼠肺重/體重比( LW/BW)

圖4 NS 組與ISO 組小鼠心肌細胞橫截面積( CDA)

圖5 NS 組與ISO 組小鼠心肌細胞ANP 表達

圖6 MAPK 信號通路相關蛋白表達

討 論

本實驗采用皮下注射ISO 制備小鼠心肌肥厚模型，發(fā)現注射ISO 2 周后，小鼠心重/體重比、肺重/體重比明顯增加；心肌細胞橫截面積增大； 心肌肥厚相關蛋白及標志物P - ERK、P - JNK、ANP 等表達升高，這些結果均證明了ISO 可以誘導小鼠心肌肥厚，而ISO 組小鼠射血分數與NS 組相比有了明顯的降低，說明小鼠心臟有了病理性的變化，成功構建了心肌肥厚疾病的動物模型。

眾所周知，心肌肥厚是指心肌對容量負荷或壓力負荷的增大而產生的一種適應性的改變。但伴隨著心肌細胞的不斷肥大以及心肌細胞內蛋白質的不斷沉積，這種生理性的適應會發(fā)展為病理性的改變［7］，成為眾多心血管疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的共同病理過程與疾病惡化的重要因素，最終導致心力衰竭，引起患者的死亡［8］。

臨床研究表明，交感神經系統過度興奮主要通過增加壓力負荷誘導心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展過程［9］。而在心肌肥厚動物模型構建中也證明了這一點，興奮小鼠交感神經系統也成為構建心肌肥厚模型的主要方法［10］。ISO 作為一種β 受體激動劑，可激活小鼠交感神經系統，進而構建心肌肥厚的動物模型。心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展與細胞信號通路的激活密切相關，MAPK 家族信號轉導通路、AMPK 信號轉導通路、Wnt信號轉導通路、Jak - STAT 信號轉導通路等相互作用，從而導致心肌肥厚［11］。而作為相關信號通路基礎的MAPK 家族信號通路可被由血流動力學改變引起的心室壁機械壓力的增強所激活［12］。越來越多的研究也證明，MAPK 家族信號通路在心肌細胞的增殖、分化、凋亡過程中起到重要作用，在心肌肥代償性肥厚到病理性肥厚的轉換中起到了重要作用［13～15］。Western blot 法結果顯示P -ERK、P -JNK 等標志蛋白表達增強，說明ISO 通過激活MAPK 家族信號通路可導致心肌肥厚。

綜上所述，通過皮下注射ISO 2 周即可成功模擬慢性壓力負荷心肌肥厚的動物模型，與手術構建心肌肥厚模型相比，本研究方法不需要開腹、開胸，對小鼠的損害小，動物模型成活率高； 與皮下泵注血管緊張素Ⅱ等神經遞質構建心肌肥厚模型相比，方法能更真實的模擬自然病程，更加易于操作，同時也更為經濟，可以大量復制心肌肥厚模型。因此，皮下注射ISO 能更簡單、經濟、可靠的獲得小鼠心肌肥厚模型，為心肌肥厚相關機制的進一步的研究打下堅實的基礎，為臨床上治療心肌肥厚提供提供新的靶點。

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