蔣學(xué)友 張 建 鄭以山 王念躍 仲崇輝

近年來隨著寵物熱的興起，犬、貓等動物傷人事件增多，我國的狂犬病疫情也隨之加劇，狂犬病人數(shù)僅次于印度而居世界第2 位，2007 年我國新發(fā)狂犬病例數(shù)達(dá)3300 例，其后每年新發(fā)狂犬病例數(shù)仍維持在2000 例以上［1，2］。我國成為全球最大的人用狂犬病疫苗市場，每年使用量約為( 1200 ～1500) 萬人份，年直接費用約為(35 ～50) 億元［3］。為了提高狂犬病暴露預(yù)防接種的依從性同時降低預(yù)防接種費用，許多國家從傳統(tǒng)的5 針法(0、3、7、14、28 天單側(cè)上臂三角肌內(nèi)各注射狂犬病疫苗1 個劑量) ，改為2 -1 -1 接種方案(0、7、21 天接種3 次共4 針疫苗，首次注射劑量加倍。) ，我國從2011 年起推廣國產(chǎn)狂犬病疫苗的2 -1 -1 接種方案。目前關(guān)于狂犬病疫苗2 -1 -1接種效果的臨床報道集中于初種效果方面的觀察，未見對于復(fù)種效果這方面的臨床觀察，本試驗希望通過對國產(chǎn)狂犬病疫苗2 -1 -1 接種方案在初種與復(fù)種不同人群中的免疫效果觀察比較，為人們選擇狂犬病疫苗的預(yù)防接種提供更全面的臨床參考。

對象與方法

1.1 對象：2013 年5 ～9 月期間在筆者醫(yī)院急診科動物咬傷門診接種人狂犬病疫苗的志愿者，試驗方案經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會討論通過( 東南大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批件號：2013LS-ky004) 。入選條件為18 ～60 歲成年人群，性別不限，身體健康，符合現(xiàn)行的《狂犬病暴露預(yù)防處置工作規(guī)范.2009 版》接種條件，即3 年內(nèi)無狂犬病疫苗接種史而應(yīng)當(dāng)全程接種疫苗，并且接受2 -1 -1 接種方案的人群。簽訂知情同意書后入組觀察免疫藥效。

2.方法：(1) 試驗分組：根據(jù)志愿者3 年以前有無狂犬病疫苗接種史共分為2 組，A 組：從無狂犬病疫苗接種史的初種2 -1 -1 方案組，49 人；B 組：3 年內(nèi)沒有但是3 年以前曾經(jīng)有過狂犬病疫苗接種史的復(fù)種2 -1 -1 方案組，24 人。兩組年齡及性別比例，差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P ＞0.05) 。人用狂犬病疫苗為遼寧成大生物股份有限公司生產(chǎn)，每個劑量為0.5ml，狂犬病疫苗效價應(yīng)≥2. 5IU，產(chǎn)品批號分別為201207225、201209301、201210325、201211334、201211341、201211343、201212355、201212367。(2) 免疫效果動態(tài)檢測方案：2 組接種者分別于0、7、21、45 天每次接種狂犬病疫苗前靜脈采血2ml，3000r/min 離心5min，取血清-20℃保存用以檢測，所用試劑為寧波天潤生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的人狂犬病病毒IgG 抗體測定試劑盒( 酶聯(lián)免疫法，ELISA) ，產(chǎn)品批號：20130101。檢測過程按說明書進(jìn)行，酶標(biāo)儀讀取各個樣品A 值，樣品A 值≥陽性對照A 值為陽性，樣品A 值＜陽性對照A 值為陰性，陽性對照血清中狂犬病病毒中和抗體為0.5IU/ml，本試驗對各組血清狂犬病病毒抗體的陽性率和A 值同時進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以便觀察2 -1 -1 接種方案在初種與復(fù)種不同人群中的免疫效果，依據(jù)自愿原則，由于參與本實驗的志愿者可以自由選擇每個時間點是否采血檢測，因此每個時間點采血的樣本例數(shù)并不一定與初次(0 天) 采血的例數(shù)相同，每個時間點的陽性率( %) =陽性樣本例數(shù)/實際采血總例數(shù)×100%。

3.統(tǒng)計學(xué)方法： SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，血清人狂犬病病毒抗體的A 值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s) 表示，兩組間比較用t 檢驗，組內(nèi)多時段應(yīng)用方差分析。血清人狂犬病病毒抗體陽性率兩組間及組內(nèi)多時段比較應(yīng)用卡方檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組人群血清狂犬病病毒抗體效價A 值：2 -1 -1接種方案中，在0、7、21、45 天每個時間段血清狂犬病病毒抗體效價A 值在初種組( A 組) 、復(fù)種組( B 組) 兩組間都有統(tǒng)計學(xué)差異。組內(nèi)每個時間段血清狂犬病病毒抗體效價A 值逐漸升高，A 組的0、7天之間的A 值輕度升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P ＞0.05) ，21 及45 天的A 值都與0、7 天的A 值有統(tǒng)計學(xué)差異( P ＜0.05) ，且21、45 天兩者間的A 值也有統(tǒng)計學(xué)差異；B 組7、21、45 天的A 值與0 天的A 值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義( P ＜0.05) ，但是7、21、45 天之間的A 值無統(tǒng)計學(xué)差異( P ＜0.05) 。兩組血清狂犬病病毒抗體的A 值結(jié)果見表1。

表1 兩組血清狂犬病病毒抗體的A 值(±s)

表1 兩組血清狂犬病病毒抗體的A 值(±s)

與0 天比較，▲P ＜0.05，與7 天比較，* P ＜0.05，與21 天比較，#P ＜0.05；與A 組比較，△P ＜0.05

組別 0 天 7 天 21 天 45天A 組 0.031 ±0.014 0.054 ±0.056 0.720 ±0.337▲＊ 1.123 ±0.442▲＊#B 組 0.631 ±0.676△ 1.272 ±0.579▲△ 1.665 ±0.351▲△ 1.743 ±0.317▲△

2.血清狂犬病病毒抗體陽性率：2-1-1 接種方案中，A 組0、7 天均無陽性，21 天的陽性率為55.56%，45天陽性率93.94%，21、45 天的陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P ＜0.05) 。B 組0 天即有41.67%的陽性率，7 天時已有78.95%的陽性率，且與0 天的陽性率有統(tǒng)計學(xué)差異，21、45 天的均有100% 陽性率，與0、7 天的陽性率均有統(tǒng)計學(xué)意義。A 組、B 組兩組間血清狂犬病病毒抗體陽性率在0、7、21 天時均有統(tǒng)計學(xué)差異，45 天時組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P ＞0.05) 。兩組血清狂犬病病毒抗體的陽性率結(jié)果見表2。

表2 兩組血清狂犬病病毒抗體的陽性率［陽性率( 陽性數(shù)/總數(shù)) ］

3.不良反應(yīng)：根據(jù)每次采血時對志愿者的隨訪結(jié)果，本試驗的兩組狂犬病疫苗接種者不良反應(yīng)為低熱( ≤38℃) 伴輕微的全身肌酸不適，A、B 組分別有2人和1 人，未發(fā)生其他不良反應(yīng)，兩組間不良反應(yīng)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P ＜0.05) 。

討 論

狂犬病是急性致死性傳染病，病死率幾乎100%，雖然有救治存活的狂犬病例報道，但是此后該病例的救治方法用于別的狂犬病患者時并無效果［4］。因此目前仍然認(rèn)為狂犬病是不可救治的，但是狂犬病是可防、可控的，現(xiàn)在世界上許多國家已經(jīng)消除了狂犬?。?］。這與狂犬病疫苗的廣泛接種有重要關(guān)系。目前國際上狂犬病疫苗接種有5 針法，也有4 針法(2 -1 -1 接種方案) ，兩種免疫作用被認(rèn)為是等效的［6］。根據(jù)WHO 推薦標(biāo)準(zhǔn)，血清狂犬病病毒中和抗體效價應(yīng)達(dá)到0.5IU/ml 以上，才能有效預(yù)防狂犬病［7］，未能達(dá)到0.5IU/ml 以上者需加強(qiáng)免疫。快速熒光灶抑制試驗( rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT) 常被看作檢測狂犬病病毒中和抗體的“金標(biāo)準(zhǔn)”，主要用于專業(yè)實驗室檢測，據(jù)報道ELISA檢測狂犬病疫苗免疫前和免疫后的狂犬病病毒抗體敏感度和特異性與RFFIT 一致［8，9］。而且有報道ELISA 檢測狂犬病病毒抗體的結(jié)果與小鼠顱內(nèi)接種及小鼠中和試驗結(jié)果也具有一致性［10］。ELISA 由于不需要接觸感染性病毒，故安全性好，而且廉價、快速又易操作，故本試驗選用ELISA 檢測法對本試驗志愿者血清中狂犬病病毒中和抗體進(jìn)行檢測，用每孔樣本讀取的A 值作為相對定量的指標(biāo)間接體現(xiàn)血清狂犬病病毒中和抗體效價，用以動態(tài)監(jiān)測臨床免疫效果。

本試驗顯示狂犬病疫苗的初種組與復(fù)種兩組人群在0、7、21 天的血清狂犬病病毒抗體的陽性率和A值比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，兩組人群在45 天時的陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是在A 值方面差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義?？袢∫呙鐝?fù)種組人群7 天血清狂犬病病毒抗體效價的A 值快速上升，A 值均數(shù)達(dá)1.272 ±0.579，陽性率高達(dá)78.95%，抗體效價與陽性率與0 天時比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，21、45 天的抗體效價的A 值進(jìn)一步升高，陽性率均為100%；而初種組7 天時血清狂犬病病毒抗體效價的A 值上升緩慢，A 值均數(shù)為0.054 ±0.056，未出現(xiàn)抗體陽性結(jié)果，抗體效價與陽性率與0 天時比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，21、45 天陽性率分別為55. 56%、93.94%。本研究顯示初種狂犬病疫苗的人群中，早期(7 天) 的血清狂犬病病毒抗體雖然有升高，無一例達(dá)到陽性標(biāo)準(zhǔn)，這與有的文獻(xiàn)報道有不同［11］。但是也有研究顯示早期(7 天) 的血清狂犬病病毒抗體是陰性或即使出現(xiàn)陽性，但是陽性率很低［12，13］。報道早期陽性率高的文獻(xiàn)可能因為人群中包含既往有狂犬病疫苗接種史的比例較高卻沒有被剔除有關(guān)。由于初種狂犬病疫苗時早期( 7 天) 的血清狂犬病病毒抗體效價及陽性率較低，無法提供有效免疫保護(hù)，所以我國《狂犬病暴露預(yù)防處置工作規(guī)范( 2009 版) 》要求對于重度的狂犬病暴露人群初種狂犬病疫苗時，除了接種全程狂犬病疫苗主動免疫，還應(yīng)該接種抗狂犬病血清( 由于過敏等反應(yīng)明顯，現(xiàn)在較少使用) 或人狂犬病免疫球蛋白的被動免疫以便早期清除狂犬病病毒的入侵，但是由于人狂犬病免疫球蛋白需要從接種狂犬病疫苗后的健康人群血液中提取，故資源緊缺且價格昂貴，往往無法及時獲得，因此初種狂犬病疫苗者比復(fù)種者更容易面臨狂犬病毒早期侵入的風(fēng)險。這也提示我們對于從事狂犬病高暴露風(fēng)險者( 包括從事狂犬病研究的實驗室工作人員、接觸狂犬病病人的醫(yī)護(hù)人員、獸醫(yī)等) 應(yīng)當(dāng)進(jìn)行暴露前免疫，這樣當(dāng)出現(xiàn)狂犬病暴露后，及時復(fù)種狂犬病疫苗即可快速提供早期免疫保護(hù)，而不用擔(dān)憂因人狂犬病免疫球蛋白的短缺而延誤預(yù)防免疫，也節(jié)省了使用人狂犬病免疫球蛋白的高額費用。

綜上所述，本研究通過對狂犬病疫苗2 -1 -1 接種方案的不同人群接種效果的動態(tài)監(jiān)測顯示，復(fù)種組的免疫效果明顯優(yōu)于初種組，更容易提供有效的的早期(7 天) 免疫保護(hù)，因此建議從事狂犬病高暴露風(fēng)險者進(jìn)行暴露前免疫是非常必要的。由于本研究重點是狂犬病疫苗2 -1 -1 方案的初種與復(fù)種效果的動態(tài)觀察，該方案的接種時間點是0、7、21 天，沒有3 天的接種時間點，沒辦法對0、3 天各接種一個劑量的對比研究。本課題后續(xù)研究工作將進(jìn)行對含有0、3 天疫苗接種點的5 針法接種人群的初種與復(fù)種者免疫效果對比研究，從而為人們對狂犬病疫苗的接種效果提供更廣泛的認(rèn)識。

1 Zhang J，Jin Z，Sun GQ，et al. Analysis of rabies in China： transmission dynamics and control［J］.PLos One，2011，6(7) ： e20891

2 Harshal S，Sanjeev K，Rizwan SA，et al.Feasibility of sustainable provision of intradermal post exposure prophylaxis against rabies at primary care level -evidence from rural Haryana［J］. BMC Health Services Research，2014，14(1) ：278

3 衛(wèi)生部，公安部，農(nóng)業(yè)部，國家食品藥品監(jiān)督管理局.中國狂犬病防治現(xiàn)狀［R］.衛(wèi)生部公報2009.11，衛(wèi)疾控發(fā)［2009］92 號［R］.2009

4 Willoughby RE ，Tieves KS，Hoffman GM，et al. Survival after Treatment of Rabies with Induction of Coma［J］. N Engl J Med，2005，352(24) ： 2508 -2514

5 Yousaf MZ，Qasim M，Zia S，et al. Rabies molecular virology，diagnosis，prevention and treatment［J］. Virol J，2012，9(1) ：50

6 Deborah JB. The role of vaccination in rabies prevention［J］. Curr Opio Virol，2012，2(3) ：309 -314

7 Henry W.Rabies Postexposure vaccination：are antibody responses adequate［J］. Clin Infect Dis，2012，55(2) ：206 -208

8 Muhamuda K，Madhusudana SN，Ravi V.Development and evaluation of a competitive ELISA for estimation of rabies neutralizing antibodies after post - exposure rabies vaccination in humans［J］. lnt J lnfect Dis，2007，11(5) ：441 -445

9 Feyssaguet M，Dacheux L，Audry L，et al. Multicenter comparative study of a new ELISA，PLATELIA RABIES II，for the detection and titration of anti - rabies glycoprotein antibodies and comparison with the rapid fluorescent focus inhibition test ( RFFIT) on human samples from vaccinated and non - vaccinated people［J］. Vaccine，2007，25(12) ：2244 -2251

10 徐葛林，吳杰，吳泰才，等.多種方法對廣西地區(qū)健康犬帶狂犬病毒的調(diào)查［J］.中國人獸共患病雜志，1999，15(3) ：108 -109

11 Wang LY，Sun MP，Zhang XC，et al.Safety and immunogenicity of two freeze-dried Vero cell rabies vaccines for human use in post-exposure prophylaxis［J］. Vaccine，2011，29 (15) ：2679 -2681

12 Yanagisawa N，Takayama N，Mannen K，et al.Immunogenicity of intradermal vaccination of Japanese rabies vaccine for preexposure immunization following WHO recommendation［J］. J Infect Chemother，2012，18(1) ： 66 -68

13 Kulkarni PS，Sapru A ，D，costa PM，et al. Safety and immunogenicity of a new purified vero cell rabies vaccine ( PVRV) administered by intramuscular and intradermal routes in healthy volunteers［J］. Vaccine，2013，31(24) ：2719 -2722