張 琳 富澤龍 馮 銳

放射治療是治療惡性腫瘤的重要手段，隨著放療的普遍應用，放射性皮膚損傷給很多腫瘤患者帶來額外的痛苦。傳統(tǒng)治療方法治療放射性皮膚損傷包括藥物治療和外科手術治療，效果均不理想，使其成為整形外科的難愈性疾病之一。皮膚組織工程是解決這一難題的新希望。文獻研究證實，脂肪干細胞( adipose-derived stem cells，ASCs) 可減輕炎性反應，促進肉芽組織沉積，促進再上皮化、血管重建及創(chuàng)面收縮，并可分化為表皮細胞、血管內皮細胞，因而可促進創(chuàng)面愈合［1～5］。本研究以人來源ASCs 作為種子細胞，以人來源PRP 作為載體，觀察ASCs-PRP 復合物對裸鼠放射性皮膚損傷創(chuàng)面愈合的影響。

資料與方法

1.實驗動物及主要試劑、儀器：8 周齡健康雌性裸鼠24只，體重250 ～300g，由中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所實驗動物中心提供。高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清( 美國GIBCO公司) ； Ⅰ型膠原酶、胰酶( 美國Sigma 公司) ； CD29、CD44、CD105 熒光標記抗體( 美國BD Bioscience 公司) 。脂肪組織：人脂肪組織來源于健康成年人腹部及股部吸脂手術抽吸物。

2.ASCs 的提取、培養(yǎng)及鑒定： 筆者采用稍加改動的Zuk法通過脂肪抽吸手術獲得健康成年人脂肪組織： 首先用D -hanks 液洗滌，去除脂肪抽吸物中的血細胞和麻醉藥，然后0.2%Ⅱ型膠原酶消化1h，之后用D-Hanks 再次洗滌2 遍，去除其中殘留的膠原酶［6］。1200r/min 離心5min，離心后收集細胞。將細胞以2 ×106個/毫升的密度接種于T75 中，培養(yǎng)液含58% DMEM/F12 +40%MCDB-201、2%胎牛血清、10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF，1 ×胰島素-轉鐵蛋白-亞硒酸( insulin-transferrin-selenium，ITS) 、1 ×亞油酸-牛血清白蛋白( linoleic acid-bovine serum albumin，LA -BSA) 、50μmol/L β巰基乙醇、2mmol/L L-谷氨酰胺、100μg/ml 青霉素和100U/ml 硫酸鏈霉素( 傳代培養(yǎng)時不用雙抗) 的培養(yǎng)基中，在溫度37℃、濕度95%、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24h 后將培養(yǎng)液及其中未貼壁的細胞吸出，重新種到新的T75 中，原瓶更換新鮮培養(yǎng)液，以后每3 天換液。當細胞培養(yǎng)至80% ～90%融合時，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 常規(guī)消化，細胞按照1∶3 進行傳代。取第3 代的ASCs 以2 ×104/ml 的密度接種于T25 培養(yǎng)瓶，12h 后，將培養(yǎng)基改為脂肪誘導培養(yǎng)基( 高糖DMEM 培養(yǎng)基中加入10% FBS、1 × 10-6mol/L 地塞米松、50μg/ml 抗壞血酸和100μg/ml IBMX) ，每隔2 天半量換液1次。倒置顯微鏡下觀察脂肪滴的形成( 圖1) 。

圖1 ASCs 的培養(yǎng)及鑒定

3.PRP 的制備： 大量研究證明，二次離心法提取的PRP 質量最高，其在臨床上的應用也最廣，因此筆者采用Landesberg 二次離心法［7］。(1) 將外周血20ml 抽入含抗凝劑(100g/L 枸櫞酸鈉，1ml) 的無菌試管中。(2) 第1 次離心，離心后血液分為3 層：上層為貧血小板血漿，主要成分是纖維蛋白原等；中層為高度濃縮的血小板，下層為紅細胞。吸取全部的上清液直達交界面下3mm( 上層、中層以及鄰近中層的部分紅細胞) ，將其移入另一無菌試管中。( 3) 再次離心，離心后血漿分為3 層：下層為少許紅細胞，上層為貧血小板血漿，兩層之間便為富血小板血漿層。吸棄上清液，留適量血漿以容納并稀釋高濃度的血小板。( 4) 將PRP 與凝血酶( 1ml 10%CaCl2溶液+1000U 凝血酶) 按9∶1比例混勻，常溫放置1h后，置于4℃冰箱內過夜。次日以5000r/min 速度離心10min，吸取上清液，0.22μm 濾器過濾除菌，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4.實驗分組及方法：根據(jù)修復方法不同，將24 只裸鼠隨機分為4 組，每組6 只。以鉛磚遮蔽創(chuàng)面以外部位，在裸鼠背部行直徑為2cm 的圓形區(qū)域的60Co 照射，照射條件：劑量20Gy，照射時間368s，劑量率326.1r/min。照射后即刻在裸鼠背部制備直徑為1cm 的皮膚全層缺損創(chuàng)面( 圖2) 。模型完成后即刻，各組分別予以以下干預：ACSs+PRP 組創(chuàng)面滴加ASCs -PRP 復合物0.2ml( 含ACSs 1 × 107個細胞/毫升) ，ASCs 組創(chuàng)面滴加ASCs 0.2ml( 含ACSs 1 ×107個細胞/毫升) ，PRP 組創(chuàng)面滴加PRP 凝膠0.2ml，空白組創(chuàng)面不加干預，直接覆蓋敷料。術后7、14 天各創(chuàng)面愈合情況，并拍照，計算愈合曲線； 組織學觀察炎性反應，免疫組織化學染色計數(shù)CD31 陽性細胞的分布情況。

5.統(tǒng)計學方法：應用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以均數(shù)±標準差(±s) 表示，行多因素方差分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.創(chuàng)面大體觀察： ASCs + PRP 組： 術后7 天，創(chuàng)面滲出不多，較為干燥，肉芽組織新鮮，創(chuàng)面約60%愈合；術后11 天，創(chuàng)面完全愈合，新生上皮外觀與正常皮膚相似，但顏色較周圍皮膚稍紅，稍顯凹陷。PRP組：術后7 天，創(chuàng)面有少量滲出，邊緣開始有新生上皮爬行，肉芽組織新鮮，色鮮紅；術后14 天，創(chuàng)面滲出不多，約70%愈合，但愈合質量不如實驗組。ASCs 組：術后7 天，創(chuàng)面少量滲出，創(chuàng)面可見皮島形成； 術后14天，創(chuàng)面少量滲出，沒有完全愈合?？瞻捉M( sham 組) ：術后7 天，創(chuàng)面可見滲出，散在皮島形成，肉芽組織新鮮，色紅，觸之易出血。術后14 天，創(chuàng)面沒有完全愈合。Image J 軟件測定各時點殘留創(chuàng)面面積并繪制創(chuàng)面愈合曲線。如圖3 所示，ASCs +PRP 組愈合速度最快，與其余組差異均有統(tǒng)計學意義( P ＜0.05)，PRP 及ASCs 組愈合速度次之，與sham 組差異有統(tǒng)計學意義( P ＜0.05) ，而PRP 組與ASCs 組差異無統(tǒng)計學意義( P ＞0.05) 。

2.HE 染色觀察創(chuàng)面炎性反應：各組分別術后14天行創(chuàng)面組織切片，行HE 染色( 圖4) 。ASCs +PRP組創(chuàng)面愈合良好，創(chuàng)面新生血管密度較大，可見炎性細胞浸潤。PRP 組： 仍有部分創(chuàng)面未能愈合，肉芽組織生長良好，新生血管密度較為豐富，肉芽組織及創(chuàng)面表面可見較多炎性細胞浸潤。ASCs 組： 部分創(chuàng)面未能愈合，肉芽組織中新生血管數(shù)量較為豐富，并可見較多炎性細胞浸潤。sham 組： 相當一部分創(chuàng)面未能愈合，存在較為明顯的炎性細胞浸潤，肉芽組織中可見新生血管。

圖2 創(chuàng)面模型制作及大體觀察

圖3 創(chuàng)面愈合曲線

3.CD31 染色觀察創(chuàng)面微血管密度： 術后第14天，各組創(chuàng)面CD31 染色如圖5 所示。ASCs +PRP 組與其他3 組比較，差異有統(tǒng)計學意義( P ＜0. 05) ，ASCs 組差異與PRP 組無統(tǒng)計學意義，但均與sham組比較差異有統(tǒng)計學意義( P ＜0.05，圖6) 。

圖4 術后第14 天，各組HE 染色( ×100)

討 論

圖5 術后第14 天，各組CD31 染色( ×100)

圖6 術后第14 天，各組微血管計數(shù)

放射性皮膚損傷早期表現(xiàn)為急性放射性皮膚炎癥，這是一種以紅斑、水腫、表皮增厚、瘙癢及脫屑為特征的急性炎癥。急性炎癥期過后，逐漸進入慢性纖維化時期，這一時期以組織彈性下降，創(chuàng)面遷延不愈，色素加深，甚至形成放射性壞死和放射性潰瘍。放射損傷的本質在于創(chuàng)面的微血管數(shù)量減少和纖維化的增加。伴隨分子生物學的不斷發(fā)展，關于放射性皮膚損傷的機制研究，已經從形態(tài)學和病理生理學水平逐步深入到了蛋白和基因等分子水平。目前研究認為，輻射產生的活性氧和自由基可以損傷上皮細胞基底層，使基底層細胞分裂、增殖以及向表層的遷移和角化受阻，導致皮膚損傷，并延緩創(chuàng)面修復過程；大劑量射線照射可引起p53 和Bax 蛋白高表達，導致皮膚組織內正常細胞凋亡，血管內皮細胞、成纖維細胞及表皮細胞數(shù)量減少，影響新生血管形成、創(chuàng)緣收縮以及創(chuàng)面表皮化過程抑制，因而造成肉芽組織形成不良、創(chuàng)面延遲愈合［8］。研究發(fā)現(xiàn)，放射線照射可抑制局部血管內皮細胞及成纖維細胞等合成與分泌VEGF、TGF-β 及BFGF 等細胞因子，而這些細胞是創(chuàng)面愈合重要的始動因素和促進因素［9］。放射性潰瘍一旦發(fā)生，則難以愈合，如不及時治療，局部感染加上放射效應的作用，極易引起創(chuàng)面加深，可能繼發(fā)骨壞死、骨髓炎、急性出血、全身感染等危急重癥。傳統(tǒng)治療方法包括藥物治療和外科手術治療，效果均不理想，已成為整形外科的難治性疾病之一。皮膚組織工程是解決這一難題的新的希望。文獻研究證實，ASCs 可減輕炎性反應，促進肉芽組織沉積，促進再上皮化、血管重建及創(chuàng)面收縮，并可分化為表皮細胞、血管內皮細胞，因而可促進創(chuàng)面愈合［1～5］。但是，缺乏有效的細胞輸入方法和微環(huán)境中缺血和炎性反應均可導致細胞存活和繁殖率的下降［10～12］。

PRP 是通過離心全血而得到的含有高濃度血小板的血漿。PRP 中含有多種生長因子，如血小板衍生生長因子( platelet derivedgrowth factor，PDGF) ，轉化生長因子β( TGF -β1、TGF -β2) ，胰島素樣生長因子1( insulin-like growth factor -1，IGF -1) 、表皮生長因子( EGF) 和血管內皮細胞生長因子( vascular endothelial growth factor，VEGF) 等［13，14］。1984 年，Okuda 等［15］于首次PRP 可以促進骨缺損修復，此后PRP 一直是再生醫(yī)學領域的研究熱點，RP 已經被應用于骨科、普通外科、心胸外科和整形美容等多種學科。

本實驗將ASCs 作為種子細胞，以PRP 作為載體，觀察ASCs-PRP 復合物對放射性復合損傷創(chuàng)面愈合的影響。ASCs + PRP 組創(chuàng)面愈合速度最快，且最終愈合效果亦最佳。單純ASCs 組與單純PRP 組愈合速度快于空白對照組，這與既往研究結果相符，說明ASCs 與PRP 均具有很好的促傷口愈合作用，但本次實驗結果未能發(fā)現(xiàn)二者之間差異有統(tǒng)計學意義。在創(chuàng)面血管新生方面，ASCs +PRP 組新生微血管數(shù)量明顯較其余各組豐富，而單純ASCs 組及單純PRP組的微血管數(shù)量多于空白對照組，這也與其他研究結果相符和。研究表明，單純ASCs 與單純PRP 均具有促血管新生，促創(chuàng)面修復作用，但二者合用，效果更好。分析其原因，單用ASCs 效果欠佳可能與放射性皮膚損傷局部，促血管新生、促創(chuàng)面修復因子數(shù)量減少有關，因而影響細胞治療的效果，而PRP 的加入，恰恰矯正了局部微環(huán)境的不足，可以促進ASCs 在創(chuàng)面局部的存活和繁殖，并進一步發(fā)揮其自身的促旁分泌作用。而PRP 本身的膠體性質，理論上也有助于減少細胞在注射過程中的損傷。

本研究結果顯示，將ASCs 與PRP 合用，具有良好的促進放射性皮膚損傷創(chuàng)面修復的作用，為創(chuàng)面修復的臨床應用提供了新的思路。但這種促修復作用的具體機制如何，除了促進血管新生外，有無其他促進途徑，細胞因子和基因表現(xiàn)層次的變化，都需要進一步研究。

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