王 賢 吳宗貴

在全世界范圍內(nèi)，隨著人類生活水平的提高，社會老齡化的加劇，以動脈粥樣硬化( atherosclerosis，AS) 為病理基礎(chǔ)的心腦血管疾病逐漸成為危害人類健康的最主要的疾病。AS 及其并發(fā)癥的研究在世界各國都作為心腦血管疾病研究中的重點。隨著人們對AS 病因認識的日趨完善，血脂代謝異常、炎性反應(yīng)、氧化反應(yīng)等因素逐漸被發(fā)現(xiàn)。其中在血管缺血、損傷等病理過程中，內(nèi)皮祖細胞( endothelial progenitor cells，EPCs) 的動員和補充起著非常重要的作用，并在缺血后血管組織重構(gòu)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。EPCs 是一類具有較強增殖能力并能定向增殖為血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，具有增殖、黏附、遷移并形成血管結(jié)構(gòu)的特定能力［1］。當(dāng)前EPCs 在治療方面的應(yīng)用前景被廣泛接受。EPCs 的體外分離培養(yǎng)來源很多，其中比較成熟的方法就是從骨髓中提取分離后刺激動員細胞增殖［2］。新型復(fù)方中藥制劑斑曉膠囊，其中含有瓜蔞、薤白和三七。目前，臨床和實驗研究已經(jīng)表明，斑曉膠囊可以顯著降低血脂水平，抑制動脈粥樣硬化的進展。本研究采用不同濃度斑曉膠囊萃取液作用于小鼠骨髓源性EPCs，觀察其對細胞增殖及其功能的影響及探討其可能的作用機制，以求為復(fù)方斑曉膠囊在AS 中的治療提供實驗依據(jù)。

材料與方法

1.實驗動物：由第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部實驗動物中心提供的6 ～8 周齡的C57BL/6 雄鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

2.主要試劑：EGM -2 培養(yǎng)基( Clonetics 公司) ；Flk1 -PE流式抗體( BD Pharmingen 公司) ； CD34 -FITC 流式抗體( BD Pharmingen 公司) ； Bcl -2 抗體( Santa Cruz 公司) Bax( Santa Cruz 公 司) ； CCK8 試 劑 盒( 翊 圣 生 物 公 司) ； Transwell 小 室( Falcon 公司) 。

3.藥品：斑曉膠囊萃取液，由筆者醫(yī)院藥劑科提供。

4.小鼠骨髓EPCs 分離培養(yǎng)： 小鼠頸椎脫臼法處死，取下其股骨及脛骨，操作過程注意無菌，同時避免毛發(fā)沾染骨髓腔，小心剔除上面的肌肉組織，EGM2 培養(yǎng)基沖洗骨髓腔至骨髓腔發(fā)白。骨髓腔沖洗液用Ficoll 分離單核細胞，調(diào)整細胞密度為(2 ～3) ×106，平均接種到無菌6 孔板中，2 毫升/皿，置入37℃恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)第7 天可見大量單克隆細胞增殖，可進行流式鑒定CD -34 及VEGFR -2 雙抗表型。

5.CCK8( cell counting kit8) 法檢測細胞增殖情況：用上述提取分離EPCs 的方法將細胞懸液平均置于96 孔板中，培養(yǎng)48h 后換液，分別加藥0、20、200μg/ml，分別在加藥培養(yǎng)24、48、72h 后，向每孔加入10μl CCK8 溶劑，注意不要產(chǎn)生氣泡，重新置于37℃，5%CO2孵育箱內(nèi)4h，酶標(biāo)儀檢測490nm 處吸光度。

6.流式細胞術(shù)鑒定： 細胞培養(yǎng)4 天后分別用斑曉萃取液20μg/ml、200μg/ml 及空白對照分組刺激細胞，培養(yǎng)72h 后；吸凈培養(yǎng)基，0.25%胰酶消化細胞，加入200μl 流式Buffer，加入上述雙標(biāo)抗體( 另空白對照組準(zhǔn)備2 種抗體的單標(biāo)標(biāo)本已經(jīng)空白標(biāo)本，以作流式調(diào)補償用) ，震蕩后避光置于4℃冰箱孵育30min，取出離心1200r/min，去上清加流式Buffer，洗2遍，加300μl 的1%多聚甲醛固定，準(zhǔn)備上機檢測。

7.Transewell 法檢測細胞遷移功能變化：用上述提取分離EPCs 的方法提取培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)第7 天0.25%胰酶消化細胞，終止消化后離心去培養(yǎng)液，用PBS 洗2 遍，用無血清培養(yǎng)基M199 重懸，調(diào)整細胞密度至2 ×105；上室加入100μl 含細胞培養(yǎng)液，下室加入500μl 含藥培養(yǎng)基0、20、200μg/ml； 孵育箱內(nèi)培育24h；用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞，結(jié)晶紫染色；鏡下觀察。

8.Western blot 法：檢測EPCs 細胞Bcl-2/Bax 蛋白水平，上述方法提取EPCs 以5 ×105接種于6 孔板中，孵育箱內(nèi)培養(yǎng)4 天后各組分別加入不同濃度斑曉液，分為3 組( 0、20、200μg/ml) 。第7 天加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液每孔60μl 于冰上(4℃) 靜置15min 后12000g，4℃離心30min，采用BCA 法檢測蛋白濃度后加入上樣緩沖液，煮沸5 ～10min 變性，10%的分離膠進行SDS-PAGE 電泳，每孔上樣總蛋白約30g 左右，后進行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，TBS/T( 含0.2%Tween-20 的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水) 洗膜后加入Bcl-2、Bax 及β-actin 抗體，用5%二氨基聯(lián)苯胺(3，3' -diaminobenzidine，BSA) 稀釋(1∶1000 稀釋) ，4℃搖床12h，TBS/T洗膜后二抗室溫孵育1h，(1∶3000 稀釋) ，ECL 化學(xué)發(fā)光劑倒在PVDF 膜5min 后進行顯影。

9.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s) 表示，CCK8，流式細胞鑒定，transwell 實驗均采用t 檢驗進行數(shù)據(jù)分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.不同濃度的斑曉制劑可影響鼠源EPCs 的增殖：CCK8 實驗結(jié)果表明，斑曉低劑量組(20μg/ml) 和高劑量組(200μg/ml) 與對照組相比細胞增殖能力明顯增強［P ＞0.05( 第1 天、第2 天20μg/ml 斑曉組) ，P ＜0.05 ( 第3 天) ，圖1］。

圖1 不同濃度斑曉對EPCs 增殖的影響

2.流式細胞術(shù)鑒定CD34/Flk-1 雙陽性細胞：實驗結(jié)果表明，斑曉低劑量組(20μg/ml) (4.42% ±1.12%，P ＜0.05) 和高劑量組( 200μg/ml) ( 13.98%±0. 23%，P ＜0. 05) 藥物作用72h 后與對照組(2.14% ±0.92%) 相比EPCs 明顯增多( 圖2) 。

圖2 流式細胞術(shù)鑒定雙陽性細胞的結(jié)果

3. Transwell 實驗檢測EPCs 遷移功能： 結(jié)果表明，斑曉低劑量組(20μg/ml) 和高劑量組(200μg/ml)藥物作用24h 后與對照組相比結(jié)晶紫染色細胞明顯增加( P ＜0.05，圖3) 。

圖3 不同濃度斑曉作用于EPCs 后細胞遷移功能明顯變化

4.不同濃度的斑曉可增加EPCs Bcl -2/Bax 比值： Western blot 法實驗結(jié)果表明，斑曉低劑量組(20μg/ml) 和高劑量組(200μg/ml) 藥物作用72h 后與對照組相比EPCs 中Bcl -2 蛋白表達水平明顯上升，Bax 蛋白水平下降，Bcl-2/Bax 比值升高( 圖4) 。

圖4 不同濃度斑曉作用于EPCs 48h 后Bcl-2 和Bax 蛋白表達水平

討 論

EPCs 可以存在于體內(nèi)多種組織中，如骨髓、血液、脂肪組織、血管內(nèi)膜等［3～5］。研究表明，內(nèi)皮祖細胞可以由外周血或骨髓中的單個核細胞誘導(dǎo)分化而成，但EPCs 主要起源于骨髓組織中，在其他組織中存在較少［6］。因此，相對來說，骨髓中的EPCs 含量豐富，取材方便，增殖能力更強，較適合作為EPCs 的取材來源。斑曉膠囊中各成分的配伍基礎(chǔ)是漢代名醫(yī)張仲景《金匱要略》中瓜蔞薤白白酒湯，近期研究表明其對心肌缺血療效較好［7］。在此著名方劑的基礎(chǔ)上結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)動脈粥樣硬化治療新進展加入三七。制作工藝上沿襲既往中藥制備的方法。

本研究通過CCK8 實驗發(fā)現(xiàn)，同樣在細胞培養(yǎng)第7 天，在藥物作用72h 的情況下，斑曉低劑量和高劑量組與對照組相比可以明顯促進EPCs 的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P ＜0.05) ，因此把72h 作為時間點進行Transwell 及Western blot 法檢測。EPCs 的表面標(biāo)記很多，有CD34、VEGFR -2( Flk -1) 、CD45、CD31等多種，鑒定方案多樣，但多選取其中2 ～3 個表面標(biāo)記作為鑒定依據(jù)［8，9］。其中CD34 是未成熟干細胞的表面標(biāo)志之一，且EPCs 最早是通過CD34 抗體包被的免疫磁珠法從臍帶血中分離獲得，同時公認Flk-1是EPCs 的表面標(biāo)志之一，故本實驗選擇CD34/Flk -1 雙陽性標(biāo)記作為流式細胞術(shù)鑒定EPCs 的方案［10］。流式鑒定的EPCs 數(shù)量與Jiang 等［11］實驗結(jié)果相符，但目前尚缺少斑曉制劑對EPCs 的增殖效果的研究，本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)斑曉對小鼠骨髓源性EPCs 增殖具有促進作用，其結(jié)果與鄺穎頤等［12］所做的三七總皂苷對EPCs 的影響結(jié)果相符。Transwell 小室實驗通過多次重復(fù)實驗取平均值的方法以降低人工誤差，最終發(fā)現(xiàn)，斑曉高、低劑量組與對照組相比可增強EPCs的遷移功能，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。本組研究還發(fā)現(xiàn)斑曉可提高Bcl-2/Bax 比值，并呈濃度依賴性。推測通過提高Bcl -2/Bax 比值抑制EPCs 凋亡是斑曉刺激EPCs 增殖活化可能的作用機制之一。

目前，斑曉膠囊可以顯著降低血脂水平已在臨床實驗中得到證實，其提出的“痰瘀同治”的治法治則尚缺少有力的西醫(yī)實驗研究報道［13］。針對AS 軟斑塊，采用“痰瘀同治”治法治則可快速消退斑塊和使斑塊趨于穩(wěn)定，其機制可能與改善EPCs 功能修復(fù)內(nèi)皮有關(guān)。本研究結(jié)果提示，斑曉能夠影響EPCs 的增殖和功能，對EPCs 凋亡過程的抑制作用是其可能的作用機制之一。本組實驗從細胞學(xué)機制方面探討了不同濃度斑曉對EPCs 增殖的影響，為今后的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，其作用的靶點機制尚有待于進一步研究。

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