劉安軍 麻獻華 楊 瑞 高 琳 陳李斌佶 章衛(wèi)平 謝志芳

RNA 干擾( RNA interference，RNAi) 是通過導入外源性小干擾RNA( small interference RNA，siRNA) ，使其通過堿基互補配對的原則與靶基因的mRNA 互補配對，繼而引發(fā)靶mRNA 的降解、達到基因沉默的目的。由于RNAi 技術具有簡單、快速和高效的優(yōu)點，目前在基因的生物學功能研究中應用非常廣泛［1］。RNAi 的效果與進入細胞內(nèi)部的siRNA 的量具有直接相關性，因此建立高效率的siRNA 轉染方法是保證基因沉默效果的先決條件［2］。

轉錄因子Sox9 高表達于軟骨細胞，是調(diào)控軟骨發(fā)育的關鍵分子之一［3］。為了進一步研究該分子在軟骨細胞中的分子調(diào)控機制，需要建立有效的RNAi方法。然而原代軟骨細胞被多種細胞外基質(zhì)包圍，應用一般的化學或物理轉染方法很難達到理想的轉染效率，而且原代軟骨細胞在體外培養(yǎng)很容易去分化，不宜應用需要篩選的shRNA ( short hairpin RNA)［4］。目前文獻中應用較多的是通過核電轉法( nucleofector) 轉染siRNA 達到基因沉默的目的，雖然該方法轉染效率較高，但需要特殊的核電轉儀以及軟骨細胞專用的核電轉液，價格比較昂貴［5］。本研究應用商品化的高效電轉緩沖液和常規(guī)的電轉儀，通過對原代軟骨細胞進行電轉前處理和采用優(yōu)化的電轉參數(shù)，建立了原代軟骨細胞高效轉染siRNA 的方法，達到滿意的基因沉默效果和較高的細胞存活率。

材料與方法

1.原代小鼠軟骨細胞的分離： 取出生后5 天的FVB 品系小鼠2 只，分離四肢關節(jié)及肋軟骨，加入含0.1% Ⅰ型膠原酶( Worthington) 的DMEM 培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱中37℃消化1h［6］。然后在解剖鏡下刷去軟骨外的軟組織，用磷酸鹽緩沖液( PBS) 洗2 遍后，再用0.2% Ⅱ型膠原酶( 用含10%胎牛血清的DMEM 配置)37℃消化過夜。第2 天，加入1mg/ml 鏈絲菌蛋白酶( pronase，roche) 繼續(xù)消化3h，期間每隔1h 吹打1次。

2.電穿孔轉染質(zhì)粒： 將上述獲取的單個軟骨細胞在室溫下用PBS 洗兩遍，計數(shù)。用電轉緩沖液( BTX press high performance electroporation solution，harvard apparatus) 重懸細胞(5 ×105個細胞/100 微升) ，每100μl 電轉緩沖液中加入5μg pCMV-EGFP-C1( clontech) 質(zhì)粒，混勻后加入電轉杯( 2mm gap) 中。電穿孔儀采用BTX ECM 830 機型( harvard apparatus) ，脈沖電壓和時間為170V/15ms。電穿孔后立刻加入1ml已預溫的高糖DMEM 培養(yǎng)基( 含有10%胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml 鏈霉素，2. 5μg/ml 兩性霉素B，25μg/ml L-維生素C 磷酸酯) ，并轉移至24 孔培養(yǎng)皿中，取少許細胞進行臺盼藍染色計數(shù)細胞活率，其余的細胞繼續(xù)培養(yǎng)48h。

3.轉染效率確定：電穿孔后48h，在熒光顯微鏡下隨機取10 個視野，計數(shù)表達綠色熒光蛋白( 發(fā)綠光) 的細胞數(shù)，同時在可見光下計數(shù)細胞總數(shù)。計算轉染率( %) =( 發(fā)出綠色熒光的細胞數(shù)/總細胞數(shù)) ×100%。

4.siRNA 轉染及基因沉默效果的評估： 將用上述方法處理得到的原代軟骨細胞，用電轉緩沖液重懸細胞(5 ×105個細胞/100 微升) ，在每100μl 電轉緩沖液中加入5μl 10μmol/L對照siRNA 或Sox9 siRNA( Santa Cruz 公司，sc -37007，SC -36534) ，混勻后加入電轉杯(2mm gap) 中，選擇170V/15ms 進行電轉，電轉后加入培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。收獲細胞用常規(guī)方法提取總RNA 和總蛋白，進行real-time PCR 以及Western blot 法檢測分析Sox9 的mRNA 和蛋白表達量。實驗重復3 次。

5.real-time PCR 分析：將總RNA 用DNAase 處理后反轉錄成cDNA，然后采用SYBR Green( Invitrogen) 反應體系進行real-time PCR 分析。Sox9 和內(nèi)參36B4 的引物序列見表1。

表1 real-time PCR 所用引物的序列

6.Western blot 法分析：將得到的總蛋白定量后進行裂解變性，經(jīng)10% SDS - PAGE 電泳分離后，轉至硝酸纖維素膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST 室溫封閉1h 后沿60kDa marker處裁開，分別加入一抗Sox9 抗體( Santa Cruz 公司，sc-20095)與β-actin 抗體( Proteintech 公司) ，4℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次，每次5min，分別加入辣根過氧化物酶標記的二抗( 美國Vector 公司) ，室溫孵育1h，TBST 洗膜3 次后，化學曝光顯影。并用隨機附帶軟件對目的條帶進行灰度值掃描，計算出Sox9與內(nèi)參β-actin 的灰度值比值，進行蛋白的半定量分析。

結 果

1.電穿孔后原代軟骨細胞的存活率與質(zhì)粒轉染率分析：臺盼藍染色顯示，采用170V 電壓和15ms 的電轉參數(shù)進行電穿孔pCMV -EGFP -C1 質(zhì)粒后，原代軟骨細胞的存活率為81.7% ± 3.6%。轉染后48h，大部分細胞呈典型的軟骨細胞形態(tài)( 卵圓形) ，其中部分細胞發(fā)綠色熒光，提示成功導入外源的綠色熒光蛋白( EGFP) 表達質(zhì)粒( 圖1) 。EGFP 陽性細胞數(shù)為37.3% ±5.2%。

圖1 原代軟骨細胞電穿孔轉染pCMV-EGFP-C1質(zhì)粒48h 后表達綠色熒光蛋白(EGFP)

2.siRNA 轉染后的細胞存活率與RNAi 效果分析：電轉對照和Sox9 siRNA 后，原代軟骨細胞的存活率分別為83.7% ±5.2%和85.0% ±3.5%。實時PCR 和Western blot 法檢測分析結果表明，原代軟骨細胞轉染Sox9 siRNA 48h 后，Sox9 mRNA 和蛋白的相對表達量與轉染對照siRNA 組相比分別下調(diào)了75% ±4%和66% ±10%，達到了理想的基因沉默效果( 圖2) 。

討 論

本研究應用商品化的高效電轉緩沖液和普通電轉儀，建立了原代軟骨細胞高效轉染siRNA 的方法，達到了理想的基因沉默效果和較高的細胞存活率。實驗成功的關鍵主要與以下幾個因素相關。

圖2 原代軟骨細胞轉染Sox9 siRNA 48h 后Sox9 mRNA 和蛋白表達下調(diào)

首先，電穿孔前原代軟骨細胞的充分消化至關重要。軟骨細胞能分泌多種細胞外基質(zhì)，這些細胞外基質(zhì)在軟骨細胞周圍形成較致密的結構［7］。常規(guī)的Ⅰ型和Ⅱ型膠原酶處理能夠得到游離的單個軟骨細胞，但并不能徹底地將包裹在細胞膜外的基質(zhì)成分消化掉，這樣就會大大影響電穿孔的效率。筆者在預實驗中發(fā)現(xiàn)將用Ⅰ型和Ⅱ型膠原酶消化的軟骨細胞直接進行電穿孔，同樣的電穿孔條件會導致大量細胞死亡。因此筆者用1mg/ml 鏈絲菌蛋白酶( pronase) 對這些已經(jīng)游離的軟骨細胞進一步消化，并通過間斷吹打促使其細胞外基質(zhì)的酶解。鏈絲菌蛋白酶是從鏈球菌( streptomyces griseus) 中分離到的含有多種肽鏈內(nèi)切酶( 絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶) 和外肽酶的混合物，因此能將很多種蛋白水解成單個氨基酸( https： //lifescience.roche.com/) 。將該酶的濃度和消化時間控制在適當范圍內(nèi)，可以用于消化細胞外基質(zhì)。事實上該酶也被應用于人軟骨細胞的核電轉前處理［5］。

其次，筆者選用了商品化的高效電轉緩沖液，雖然不知道該緩沖液的具體成分，但該種緩沖液能提高一些普遍被認為難以電轉的細胞的存活率與轉染效率( http： //www. btxonline. com/) 。筆者的實驗表明該緩沖液適用于原代軟骨細胞。雖然在目前的參數(shù)條件下，質(zhì)粒的轉染率只有37.3% ±5.2%，但siRNA只有20 對左右核苷酸，比質(zhì)粒小得多［8］。因此應用目前的電穿孔參數(shù)既能保證較高的細胞存活率又能達到滿意的RNAi 效果。

當然，筆者實驗的成功還與選擇高效的Sox9 siRNA 有關。該產(chǎn)品含有3 種不同的針對靶分子的siRNAs，保證了基因沉默的效果。

1 Fellmann C S W . Lowe. Stable RNA interference rules for silencing［J］. Nat Cell Biol，2014，16(1) ：10 -18

2 Nayak TR，Krasteva LK，Cai W. Multimodality imaging of RNA interference［J］. Curr Med Chem，2013，20(29) ：3664 -3675

3 Dy P，Wang W，Bhattaram P，et al. Sox9 directs hypertrophic maturation and blocks osteoblast differentiation of growth plate chondrocytes［J］. Dev Cell，2012，22(3) ：597 -609

4 Gosset M，Berenbaum T，Thirion S，et al. Primary culture and phenotyping of murine chondrocytes［J］. Nat Protoc，2008，3(8) ：1253-1260

5 Haag J，Voigt R，Soeder S，et al. Efficient non-viral transfection of primary human adult chondrocytes in a high-throughput format［J］. Osteoarthritis Cartilage，2009，17(6) ：813 -817

6 Mirando AJ，Dong Y，Kim J，et al. Isolation and culture of murine primary chondrocytes［J］.MethodsMol Biol，2014，1130：267 -277

7 Wilusz RE，J Sanchez-Adams，F(xiàn) Guilak. The structure and function of the pericellular matrix of articular cartilage［J］. Matrix Biol，2014，39C：25 -32

8 Juffermans LJ，Meijering DB，van Wamel A，et al. Ultrasound and microbubble-targeted delivery of small interfering RNA into primary endothelial cells is more effective than delivery of plasmid DNA［J］. Ultrasound Med Biol，2013，40(3) ：532 -540