摘要：在微波輻射下，用水提醇沉法提取金蓮花多糖，Seavg法除去蛋白，苯酚-硫酸法測定金蓮花中多糖含量；通過單因素和正交試驗，探索微波輔助下多糖提取的最佳工藝，并測定比較人工種植與道地野生金蓮花中的多糖含量，對人工種植金蓮花的藥用品質(zhì)進行評價。結(jié)果表明，人工種植金蓮花多糖含量為2.53%，最佳提取工藝條件為微波功率400W、料液比1∶20、微波輻射時間30min、浸泡時間60min；人工種植金蓮花多糖含量較高，完全可滿足藥用。

關(guān)鍵詞：人工種植；金蓮花；多糖；提取工藝；藥用品質(zhì)；評價

中圖分類號：O657.32；R284.2文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0332-02

植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗腫瘤、抗凝血和降血糖等作用，可作為治療疾病的藥物和保健食品。植物多糖來源廣泛，毒副作用低，安全性好，無致癌作用[1-2]。金蓮花為毛茛科植物金蓮花（TrolliuschinensisBunge）的干燥花及其花蕾，味苦、性寒、無毒，可治口瘡喉腫、浮熱牙宣、耳疼目痛[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，金蓮花具有抗菌、抗病毒等活性，用于治療慢性扁桃體炎、感冒、發(fā)燒、急性鼓膜炎、尿路感染等其他炎癥。文獻報道，金蓮花中主要含有黃酮類、有機酸、糖類、蛋白質(zhì)等[4]。目前，對金蓮花的開發(fā)研究多限于野生金蓮花蛋白質(zhì)、黃酮類、有機酸類化合物的提取分離和藥理活性研究[5-9]，而對人工種植金蓮花多糖的提取分離報道不多。隨著市場需求量的不斷增加，野生金蓮花已遠遠不能滿足消費者需求，近年來，各地廣泛進行人工種植金蓮花。試驗通過測定寧夏回族自治區(qū)隆德西北中藥材有限公司人工種植的金蓮花多糖含量，并與野生金蓮花多糖含量進行比較，判斷其藥用價值，為人工種植金蓮花的廣泛應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試材與前期處理

人工種植金蓮花采自寧夏回族自治區(qū)隆德縣西北中藥材有限責(zé)任公司種植基地；山西五臺山、河北承德、長白山、內(nèi)蒙古赤峰的野生金蓮花購買于寧夏明德中藥飲片有限公司，由注冊藥劑師趙建軍鑒定。將試材放入恒溫箱中，60℃烘干至恒質(zhì)量，取出自然陰干、粉碎，過80目篩，依次用石油醚、丙酮處理2次，除去脂類和色素，再用80%乙醇處理2次，除去單糖、低聚糖苷類等物質(zhì)，干燥至恒定質(zhì)量，備用。

1.2主要儀器與試劑

UV-2450型紫外可見分光光度計，日本島津公司生產(chǎn)；FW-177型中草藥粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)；XH-300A微波催化合成/萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；pHs-2C型精密酸度計，上海雷磁儀器廠生產(chǎn)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；L-S電子天平，精度0.1mg，梅特勒-托利多儀器公司生產(chǎn)。苯酚、98%H2SO4、NaOH、葡萄糖、無水乙醇、CHCl3、正丁醇等，均為國內(nèi)產(chǎn)分析純（AR）；水為純凈水。

1.3試驗方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立取適量葡萄糖于烘箱內(nèi)，105℃烘干至恒定質(zhì)量[10]；精確稱取10mg葡萄糖，加純水溶解并定容到100mL，配制成0.1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別移取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL于25mL具塞刻度試管中，以純水補至2.0mL，順序加入5%苯酚溶液1.0mL和濃硫酸5.0mL，振搖均勻，靜置20min；以試劑空白為參比，在波長490nm處測定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)（D）、葡萄糖含量為縱坐標(biāo)（C），獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為C=0.0833D-0.00067（r=0.9993），葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在0.01～0.16mg/mL之間，與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

1.3.2金蓮花多糖的提取準(zhǔn)確稱取預(yù)處理的金蓮花樣品1.00g，加適量純凈水于50℃浸泡，按不同液料比、微波功率、微波輻射時間和浸泡時間等條件進行微波提取，以4000r/min離心15min，取上清液；將濾渣在同樣條件下再浸提1次，合并2次所得濾液，減壓濃縮；向濃縮液中加入1/4倍體積的氯仿-正丁醇（V∶V=4∶1），混合20min，3500r/min離心10min，取上清液，重復(fù)5～6次，至中間無明顯沉淀為止；將上清液轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，用純水定容至刻度，作為供試樣品溶液。

1.3.3多糖含量的測定取樣品液0.1mL，置于25mL容量瓶中，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的方法配制樣品溶液并定容至25mL，用UV-2450型紫外可見光分光光度計測定波長490nm處吸光度，計算多糖提取量和多糖含量，計算公式為：多糖提取量（g/mL）=多糖質(zhì)量濃度（mg/mL）×10-3×稀釋倍數(shù)；多糖含量（%）=多糖提取量×100/金蓮花樣品質(zhì)量。

1.3.4提取工藝研究分別考察液料比、微波輻射時間、微波功率和浸泡時間4個因素對多糖提取的影響；采用4因素3水平正交試驗，對提取過程中液料比（A）、微波功率（B）、微波輻射時間（C）和浸泡時間（D）進行優(yōu)化工藝研究。

2結(jié)果與分析

2.1單因素對金蓮花多糖提取的影響

2.1.1料液比對多糖提取的影響稱取預(yù)處理人工種植金蓮花1.00g各5份，分別取料液比（g∶mL）為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，固定微波功率400W、浸泡時間60min、微波輻射時間30min進行多糖提取。結(jié)果表明，多糖提取率開始隨料液比的增大而增加，當(dāng)料液比大于1∶20時，隨著料液比的增大，多糖提取率反而逐漸減??；料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30時，多糖提取率依次為1.21%、1.29%、1.41%、1.39%、1.36%。這是因為隨液料比增大，溶劑與原料接觸充分，二者的傳質(zhì)作用增強，多糖的提取率增大；當(dāng)液料比大于1∶20時，隨料液比增大，微波功率相同條件下，提取液溫度呈下降趨勢，致使多糖提取得率反而下降。因此，確定金蓮花多糖提取適宜的液料比為1∶20。endprint

2.1.2微波功率對多糖提取的影響稱取預(yù)處理人工種植金蓮花1.00g各5份，固定微波輻射時間30min、液料比1∶20、浸泡時間60min，超聲功率分別為300、350、400、450、500W進行多糖提取。結(jié)果表明，隨微波功率增大，多糖提取率增大，當(dāng)功率超過400W時，多糖提取率增大趨于緩慢；功率分別為300、350、400、450、500W時，多糖提取率分別為1.19%、1.46%、1.78%、1.79%、1.81%。這可能是因為隨著微波功率增大，物系升溫加快，固液傳質(zhì)速度加快，對細胞破壞作用增大，有利于多糖浸出，但功率過高，瞬間加熱作用會使液體沸騰溢出。為節(jié)省能源，微波功率選取400W為宜。

2.1.3微波輻射時間對多糖提取的影響稱取預(yù)處理人工種植金蓮花1.00g各5份，固定微波輻射功率400W、液料比1∶20、浸泡時間60min，微波輻射時間分別為10、20、30、40、50min進行多糖提取。結(jié)果表明，多糖提取率初始隨微波輻射時間的延長而增加，微波輻射時間在30min時，提取率最高，當(dāng)輻射時間大于30min時，多糖提取率反而下降；微波輻射時間分別為10、20、30、40、50min時，多糖提取率分別為1.39%、1.42%、1.53%、1.51%、1.48%。這可能是因為多糖熱穩(wěn)定性較差，隨微波輻射時間延長，部分多糖變性，使多糖提取率降低。因此，確定適宜的微波輻射時間為30min。

2.1.4浸泡時間對多糖提取的影響稱取預(yù)處理人工種植金蓮花1.00g各5份，固定微波輻射功率400W、液料比1∶20、微波輻射時間30min，浸泡時間分別是20、40、60、80、100min進行多糖提取。結(jié)果表明，多糖提取率隨浸泡時間的延長而增加，但當(dāng)浸泡時間大于60min時，隨浸泡時間的延長，提取率增大明顯趨于緩慢；浸泡時間分別是20、40、60、80、100min時，多糖提取率分別為0.73%、1.08%、1.86%、1.87%、1.89%。為節(jié)約時間，確定適宜浸泡時間為60min。

2.2多因素正交試驗對金蓮花多糖提取的影響

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用3水平4因素L16（34）正交試驗設(shè)計（表1），確定金蓮花多糖提取最優(yōu)提取工藝。結(jié)果由表2可見，影響金蓮花多糖提取的主要因素是微波輻射時間，各因素影響大小依次為C>B>D>A，即微波輻射時間>微波輻射功率>浸泡時間>料液比；結(jié)合單因素試驗結(jié)果，確定最佳多糖提取工藝條件為A2B3C2D2，即料液比1g∶20mL、微波功率400W、微波時間30min、浸泡時間60min。

由表3可見，微波輻射下提取金蓮花多糖的主要影響因素是微波輻射時間，微波功率、料液比和浸泡時間對多糖的提取無顯著影響。因此，提取過程中應(yīng)嚴(yán)格控制微波輻射時間，浸泡時間可適當(dāng)縮短。

2.3驗證試驗

取適量粉碎后的金蓮花，在正交試驗所得優(yōu)化提取工藝條件下進行驗證試驗，得到多糖提取率為2.53%（n=3）。

2.4不同產(chǎn)地金蓮花與人工種植金蓮花多糖含量比較

金蓮花在我國主要分布于河北、山西、內(nèi)蒙古、新疆、四川、云南、東北、陜西、甘肅、青海等省（區(qū)），山西、河北是傳統(tǒng)的金蓮花道地產(chǎn)地和栽培地[9]。從寧夏明德中藥飲片有限公司購買河北承德、山西五臺山、內(nèi)蒙古赤峰、長白山產(chǎn)的野生金蓮花，在優(yōu)化提取工藝條件下進行提取，得到多糖提取率分別為2.71%、2.62%、2.54%、2.48%（n=3），與寧夏隆德人工種植的金蓮花多糖提取率沒有顯著性差異。

3結(jié)論

利用直觀法分析微波輻射下提取金蓮花多糖，影響因素大小依次為微波輻射時間>微波輻射功率>浸泡時間>料液比，金蓮花多糖提取最佳工藝條件為料液比1∶20、微波輻射功率400W、微波輻射時間30min、浸泡時間60min。

與河北、山西、內(nèi)蒙古、長白山產(chǎn)野生金蓮花多糖含量比較，寧夏隆德西北中藥材有限公司人工種植的金蓮花多糖含量與野生差異不大，完全能滿足藥用。不過，影響金蓮花多糖含量的因素比較多，除人工種植與野生栽培方式能引起多糖含量差異之外，可能還與產(chǎn)地氣候、采摘時間、土壤養(yǎng)分等因素有關(guān)。

參考文獻：

[1]LeeBC，BaeJT，PyoHB，etal.BiologicalactivitiesofthepolysaccharidesproducedfromsubmergedcultureoftheediblebasidiomyceteGrifolafrondosa[J].EnzymeandMicrobialTechnology，2003，32（5）：574-581.

[2]DuXJ，ZhangJS，YangY，etal.Purification，chemicalmodificationandimmunostimulatingactivityofpolysaccharidesfromTremellaaurantialbafruitbodies[J].JournalofZhejiangUniversity-ScienceB，2010，11（6）：437-442.，

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[8]梁永鋒.金蓮花中綠原酸提取工藝的優(yōu)化及其含量比較[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（21）：5296-5298，5302.

[9]梁永鋒.不同產(chǎn)地野生與人工種植金蓮花黃酮含量的比較及提取工藝[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（9）：253-255.

[10]董鈺明，唐興文，張樹江，等.紅毛五加多糖的含量測定條件和提取工藝優(yōu)選[J].中南藥學(xué)，2006，4（2）：86-88.endprint

2.1.2微波功率對多糖提取的影響稱取預(yù)處理人工種植金蓮花1.00g各5份，固定微波輻射時間30min、液料比1∶20、浸泡時間60min，超聲功率分別為300、350、400、450、500W進行多糖提取。結(jié)果表明，隨微波功率增大，多糖提取率增大，當(dāng)功率超過400W時，多糖提取率增大趨于緩慢；功率分別為300、350、400、450、500W時，多糖提取率分別為1.19%、1.46%、1.78%、1.79%、1.81%。這可能是因為隨著微波功率增大，物系升溫加快，固液傳質(zhì)速度加快，對細胞破壞作用增大，有利于多糖浸出，但功率過高，瞬間加熱作用會使液體沸騰溢出。為節(jié)省能源，微波功率選取400W為宜。

2.1.3微波輻射時間對多糖提取的影響稱取預(yù)處理人工種植金蓮花1.00g各5份，固定微波輻射功率400W、液料比1∶20、浸泡時間60min，微波輻射時間分別為10、20、30、40、50min進行多糖提取。結(jié)果表明，多糖提取率初始隨微波輻射時間的延長而增加，微波輻射時間在30min時，提取率最高，當(dāng)輻射時間大于30min時，多糖提取率反而下降；微波輻射時間分別為10、20、30、40、50min時，多糖提取率分別為1.39%、1.42%、1.53%、1.51%、1.48%。這可能是因為多糖熱穩(wěn)定性較差，隨微波輻射時間延長，部分多糖變性，使多糖提取率降低。因此，確定適宜的微波輻射時間為30min。

2.1.4浸泡時間對多糖提取的影響稱取預(yù)處理人工種植金蓮花1.00g各5份，固定微波輻射功率400W、液料比1∶20、微波輻射時間30min，浸泡時間分別是20、40、60、80、100min進行多糖提取。結(jié)果表明，多糖提取率隨浸泡時間的延長而增加，但當(dāng)浸泡時間大于60min時，隨浸泡時間的延長，提取率增大明顯趨于緩慢；浸泡時間分別是20、40、60、80、100min時，多糖提取率分別為0.73%、1.08%、1.86%、1.87%、1.89%。為節(jié)約時間，確定適宜浸泡時間為60min。

2.2多因素正交試驗對金蓮花多糖提取的影響

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用3水平4因素L16（34）正交試驗設(shè)計（表1），確定金蓮花多糖提取最優(yōu)提取工藝。結(jié)果由表2可見，影響金蓮花多糖提取的主要因素是微波輻射時間，各因素影響大小依次為C>B>D>A，即微波輻射時間>微波輻射功率>浸泡時間>料液比；結(jié)合單因素試驗結(jié)果，確定最佳多糖提取工藝條件為A2B3C2D2，即料液比1g∶20mL、微波功率400W、微波時間30min、浸泡時間60min。

由表3可見，微波輻射下提取金蓮花多糖的主要影響因素是微波輻射時間，微波功率、料液比和浸泡時間對多糖的提取無顯著影響。因此，提取過程中應(yīng)嚴(yán)格控制微波輻射時間，浸泡時間可適當(dāng)縮短。

2.3驗證試驗

取適量粉碎后的金蓮花，在正交試驗所得優(yōu)化提取工藝條件下進行驗證試驗，得到多糖提取率為2.53%（n=3）。

2.4不同產(chǎn)地金蓮花與人工種植金蓮花多糖含量比較

金蓮花在我國主要分布于河北、山西、內(nèi)蒙古、新疆、四川、云南、東北、陜西、甘肅、青海等?。▍^(qū)），山西、河北是傳統(tǒng)的金蓮花道地產(chǎn)地和栽培地[9]。從寧夏明德中藥飲片有限公司購買河北承德、山西五臺山、內(nèi)蒙古赤峰、長白山產(chǎn)的野生金蓮花，在優(yōu)化提取工藝條件下進行提取，得到多糖提取率分別為2.71%、2.62%、2.54%、2.48%（n=3），與寧夏隆德人工種植的金蓮花多糖提取率沒有顯著性差異。

3結(jié)論

利用直觀法分析微波輻射下提取金蓮花多糖，影響因素大小依次為微波輻射時間>微波輻射功率>浸泡時間>料液比，金蓮花多糖提取最佳工藝條件為料液比1∶20、微波輻射功率400W、微波輻射時間30min、浸泡時間60min。

與河北、山西、內(nèi)蒙古、長白山產(chǎn)野生金蓮花多糖含量比較，寧夏隆德西北中藥材有限公司人工種植的金蓮花多糖含量與野生差異不大，完全能滿足藥用。不過，影響金蓮花多糖含量的因素比較多，除人工種植與野生栽培方式能引起多糖含量差異之外，可能還與產(chǎn)地氣候、采摘時間、土壤養(yǎng)分等因素有關(guān)。

參考文獻：

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[3]（清）趙學(xué)敏，閆冰.本草綱目拾遺[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，1998：256.

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[6]朱登祥，安芳，王書華.牡荊苷對人食管癌EC-109細胞生長及凋亡的影響[J].中草藥，2012，43（9）：1781-1784.

[7]AnF，YangGD，TianJM，etal.AntioxidanteffectsoftheorientinandvetixininTrolliuschinensisBungeinD-galactose-agedmice[J].NeuralRegenerationResearch，2012，7（33）：2565-2575.

[8]梁永鋒.金蓮花中綠原酸提取工藝的優(yōu)化及其含量比較[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（21）：5296-5298，5302.

[9]梁永鋒.不同產(chǎn)地野生與人工種植金蓮花黃酮含量的比較及提取工藝[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（9）：253-255.

[10]董鈺明，唐興文，張樹江，等.紅毛五加多糖的含量測定條件和提取工藝優(yōu)選[J].中南藥學(xué)，2006，4（2）：86-88.endprint

2.1.2微波功率對多糖提取的影響稱取預(yù)處理人工種植金蓮花1.00g各5份，固定微波輻射時間30min、液料比1∶20、浸泡時間60min，超聲功率分別為300、350、400、450、500W進行多糖提取。結(jié)果表明，隨微波功率增大，多糖提取率增大，當(dāng)功率超過400W時，多糖提取率增大趨于緩慢；功率分別為300、350、400、450、500W時，多糖提取率分別為1.19%、1.46%、1.78%、1.79%、1.81%。這可能是因為隨著微波功率增大，物系升溫加快，固液傳質(zhì)速度加快，對細胞破壞作用增大，有利于多糖浸出，但功率過高，瞬間加熱作用會使液體沸騰溢出。為節(jié)省能源，微波功率選取400W為宜。

2.1.3微波輻射時間對多糖提取的影響稱取預(yù)處理人工種植金蓮花1.00g各5份，固定微波輻射功率400W、液料比1∶20、浸泡時間60min，微波輻射時間分別為10、20、30、40、50min進行多糖提取。結(jié)果表明，多糖提取率初始隨微波輻射時間的延長而增加，微波輻射時間在30min時，提取率最高，當(dāng)輻射時間大于30min時，多糖提取率反而下降；微波輻射時間分別為10、20、30、40、50min時，多糖提取率分別為1.39%、1.42%、1.53%、1.51%、1.48%。這可能是因為多糖熱穩(wěn)定性較差，隨微波輻射時間延長，部分多糖變性，使多糖提取率降低。因此，確定適宜的微波輻射時間為30min。

2.1.4浸泡時間對多糖提取的影響稱取預(yù)處理人工種植金蓮花1.00g各5份，固定微波輻射功率400W、液料比1∶20、微波輻射時間30min，浸泡時間分別是20、40、60、80、100min進行多糖提取。結(jié)果表明，多糖提取率隨浸泡時間的延長而增加，但當(dāng)浸泡時間大于60min時，隨浸泡時間的延長，提取率增大明顯趨于緩慢；浸泡時間分別是20、40、60、80、100min時，多糖提取率分別為0.73%、1.08%、1.86%、1.87%、1.89%。為節(jié)約時間，確定適宜浸泡時間為60min。

2.2多因素正交試驗對金蓮花多糖提取的影響

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用3水平4因素L16（34）正交試驗設(shè)計（表1），確定金蓮花多糖提取最優(yōu)提取工藝。結(jié)果由表2可見，影響金蓮花多糖提取的主要因素是微波輻射時間，各因素影響大小依次為C>B>D>A，即微波輻射時間>微波輻射功率>浸泡時間>料液比；結(jié)合單因素試驗結(jié)果，確定最佳多糖提取工藝條件為A2B3C2D2，即料液比1g∶20mL、微波功率400W、微波時間30min、浸泡時間60min。

由表3可見，微波輻射下提取金蓮花多糖的主要影響因素是微波輻射時間，微波功率、料液比和浸泡時間對多糖的提取無顯著影響。因此，提取過程中應(yīng)嚴(yán)格控制微波輻射時間，浸泡時間可適當(dāng)縮短。

2.3驗證試驗

取適量粉碎后的金蓮花，在正交試驗所得優(yōu)化提取工藝條件下進行驗證試驗，得到多糖提取率為2.53%（n=3）。

2.4不同產(chǎn)地金蓮花與人工種植金蓮花多糖含量比較

金蓮花在我國主要分布于河北、山西、內(nèi)蒙古、新疆、四川、云南、東北、陜西、甘肅、青海等?。▍^(qū)），山西、河北是傳統(tǒng)的金蓮花道地產(chǎn)地和栽培地[9]。從寧夏明德中藥飲片有限公司購買河北承德、山西五臺山、內(nèi)蒙古赤峰、長白山產(chǎn)的野生金蓮花，在優(yōu)化提取工藝條件下進行提取，得到多糖提取率分別為2.71%、2.62%、2.54%、2.48%（n=3），與寧夏隆德人工種植的金蓮花多糖提取率沒有顯著性差異。

3結(jié)論

利用直觀法分析微波輻射下提取金蓮花多糖，影響因素大小依次為微波輻射時間>微波輻射功率>浸泡時間>料液比，金蓮花多糖提取最佳工藝條件為料液比1∶20、微波輻射功率400W、微波輻射時間30min、浸泡時間60min。

與河北、山西、內(nèi)蒙古、長白山產(chǎn)野生金蓮花多糖含量比較，寧夏隆德西北中藥材有限公司人工種植的金蓮花多糖含量與野生差異不大，完全能滿足藥用。不過，影響金蓮花多糖含量的因素比較多，除人工種植與野生栽培方式能引起多糖含量差異之外，可能還與產(chǎn)地氣候、采摘時間、土壤養(yǎng)分等因素有關(guān)。

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