陳心+馬蓉+張藝+石志祥

摘要：從形態(tài)學、生化特性、分子生物學水平對2種海洋弧菌進行菌種鑒定，將這2株菌制作成混合菌液，對大黃魚進行攻毒試驗。對2菌株16SrDNA進行PCR擴增，產(chǎn)物長度分別為1389、1477bp。利用BLAST進行比對，結(jié)果顯示菌株090625的序列與哈維氏弧菌的同源性高達99%；而菌株070925的序列與副溶血弧菌同源性高達99%。攻毒試驗發(fā)現(xiàn)，大黃魚體親魚表皮下出血和肝臟、脾臟等組織都出現(xiàn)了典型的弧菌感染病癥，大黃魚幼魚則未出現(xiàn)感染現(xiàn)象。菌株090625為哈維氏弧菌，菌株070925為副溶血弧菌。大黃魚親魚比幼魚更容易感染細菌。

關鍵詞：菌種鑒定；哈維氏弧菌；副溶血弧菌；大黃魚

中圖分類號：S944文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0251-03

隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展特別是高密度養(yǎng)殖模式的推廣，養(yǎng)殖生物的細菌性疾病發(fā)生頻率和發(fā)病范圍逐漸增大。據(jù)調(diào)查，在細菌性疾病中，弧菌屬細菌引起的疾病占很大比例?；【鷮偌毦鷱V泛存在于沿岸海水[1]、沉積物、海洋動物體中，被認為是海水魚、蝦、蟹類的一種常見致病菌[2-4]。大黃魚（Pseudosciaenacrocea）隸屬于鱸形目（Perciformes）石首魚科（Sciaenidae），主要分布于中國、朝鮮沿海水域，為我國主要海產(chǎn)經(jīng)濟魚類之一[3]。隨著大黃魚親魚培育和人工育苗等關鍵技術的突破，以及人工養(yǎng)殖技術的不斷提高，大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)得到迅猛發(fā)展。但由于養(yǎng)殖規(guī)模擴大等原因，各種病害發(fā)生也日益頻繁，尤其是細菌性疾病嚴重威脅著大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[5-7]。本研究從患病中華烏塘鱧（Bostrychussinensis）內(nèi)分離出致病菌，對大黃魚進行人工感染，觀察病癥發(fā)生情況，旨在為大黃魚臨床診斷、致病機理研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源2種海洋弧菌從患病中華烏塘鱧中分離。

1.1.2供試材料健康大黃魚（均質(zhì)量0.5kg）購自福建省寧德市養(yǎng)殖網(wǎng)箱；患病中華烏塘鱧（均質(zhì)量0.5kg）由福建省東山縣鑫宇海水養(yǎng)殖場提供；健康褐菖鲉（Sebastiscusmarmoratus，平均質(zhì)量0.5kg）購自福建省廈門市大學路水產(chǎn)市場。

1.1.3試劑蛋白胨（tryptone，LP0042）、酵母提取物（yeastextract，LP0042）、TCBS培養(yǎng)基均購自英國Oxoid公司；RNAlater購自北京Bioteke公司；ExTaqDNA聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司。其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.1.4儀器設備自動微生物檢測系統(tǒng)（AMS）VITEKJR和自動微生物檢測系統(tǒng)革蘭氏陰性菌種鑒定卡為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品；9700型PCR儀為美國PE公司產(chǎn)品；水平電泳槽為北京六一儀器廠產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱為太倉市華美生化儀器廠產(chǎn)品；HVE-50型全自動高壓滅菌鍋為日本Hirayama公司產(chǎn)品；AFX-1002-P型艾科浦超純水系統(tǒng)為臺灣頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；血小板計數(shù)器為浙江玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1菌株分離用1.5%無菌生理鹽水反復清洗患病中華烏塘鱧體表。用75%乙醇拭擦體表，對取樣部位進行消毒。用無菌接種環(huán)分別穿刺體表潰爛部位組織，取少量樣品在TCBS培養(yǎng)基上劃線，30℃培養(yǎng)1d。挑取優(yōu)勢菌落在TCBS培養(yǎng)基平板劃線分離數(shù)次，直至獲得純培養(yǎng)物菌株1、菌株2。

1.2.2回歸感染取15尾健康褐菖鲉置于水箱中，28℃海水充氣暫養(yǎng)2d，每天換水1/2。暫養(yǎng)無異常后用于回歸感染，將其中10尾魚分為A、B2個試驗組，另外5尾為對照組。用血小板計數(shù)法對菌株1、菌株2進行計數(shù)；用無菌生理鹽水分別將菌株1、菌株2稀釋，制成菌懸液1、菌懸液2，濃度均為1×1010CFU/mL。A組：每尾魚腹腔注射0.2mL菌懸液1；B組：每尾魚注射0.2mL菌懸液2；對照組：每尾魚注射0.2mL滅菌生理鹽水。觀察、記錄試驗魚發(fā)病及死亡情況。

1.2.3菌株再次分離取回歸感染試驗組中出現(xiàn)病灶的褐菖鲉體表潰爛部位樣品，在TCBS培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基平板上劃線分離數(shù)次，直至得到純化菌株。

1.2.4菌株鑒定

1.2.4.1形態(tài)學觀察利用肉眼直接觀察細菌菌落的外部形態(tài)。

1.2.4.2生化特性鑒定從分離菌株中取單菌落，利用自動微生物檢測儀VITEKJR的GNI鑒定卡進行生理生化鑒定，再分離菌株經(jīng)自動微生物檢測儀GNI鑒定卡，檢測30個生化檢測項目。

1.2.4.3分子生物學方法鑒定將單菌落用ddH2O溶解，用作PCR反應的模板。以16SrRNA的保守區(qū)設計引物，進行PCR擴增，其中正向引物為16S-F（ATCGAACGCTGGCGGCAGGC），反向引物為16S-R（TCACCCCAGTCATGAAC）。PCR擴增反應體系：10×exTaqbuffer5μL，exTaqDNA聚合酶0.25μL（1.25U），dNTP4μL（各2.5mmol），模板DNA2μL（約0.5μg），引物1（16S-R）1μL（10μmol），引物2（16S-F）1μL（10μmol），加滅菌去離子水補足體積至20μL。反應程序：95℃預變性5min；95℃變性1min，55℃退火45s，72℃延伸90s，30個循環(huán)；72℃終延伸7min。接著進行電泳檢測。將5μL樣品和2μL6×上樣緩沖液混合，加入點樣孔進行電泳。電壓為120V，約30min。電泳結(jié)束后，將瓊脂糖膠放入紫外燈下觀察。回收有目的條帶的樣品。配制1%TAE瓊脂糖膠進行產(chǎn)品回收。PCR產(chǎn)物檢測、測序。

1.2.5攻毒材料的制備將鑒定出的2種菌株涂布于LB培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)16h。用1.5%生理鹽水溶解菌株，2種菌株在生理鹽水中的最終濃度為1×108CFU/mL。采用哈維氏弧菌和副溶血弧菌的混合菌懸液為攻毒材料，比例為3∶1。endprint

1.2.6攻毒試驗

將大黃魚（均質(zhì)量400g）分別置于約25℃的海水中暫養(yǎng)2d。分為1個試驗組、1個對照組，每組4尾魚。加入1～2滴丁香酚于水桶中麻醉試驗用魚。對試驗組注射混合菌液，注射劑量為1mL/kg；對照組注射同等劑量的生理鹽水。隨時觀察攻毒組和對照組魚體的活動情況，并及時進行記錄和拍照。

2結(jié)果與分析

2.1病原菌的獲取

采用無菌操作挑取樣品、細菌分離培養(yǎng)等方法，從福建省東山縣鑫宇海水養(yǎng)殖場患病中華烏塘鱧皮膚潰爛的病灶部位分離得到2種病原菌。2種菌株在TCBS平板上的菌落基本為黃色，圓形，隆起，邊緣整齊，不透明，其中1種較為黏稠。

2.2回歸感染結(jié)果

回歸感染3d后，A組褐菖鲉全部死亡，B組有3尾褐菖鲉死亡。死亡褐菖鲉肝臟和鰓的顏色發(fā)白，膽囊腫大，有的個體尾鰭和臀鰭邊緣出現(xiàn)輕微潰瘍。未死亡的試驗魚對外界刺激反應遲鈍，鰭出血，體表病變的部位有暗紅色瘀血，鱗片脫落，皮膚出現(xiàn)潰爛，表現(xiàn)出典型的弧菌病病癥。對照組褐菖鲉表現(xiàn)正常。從患病褐菖鲉重新分離純化感染菌株，進行生化和分子生物學鑒定。

2.3病原菌鑒定

2.3.1菌落外部形態(tài)鑒定

回歸感染后再分離獲得的菌株，在TCBS平板上98%以上的優(yōu)勢菌落基本為黃色，菌落均為圓形、隆起、邊緣整齊、不透明；其中菌株2較為黏稠。菌落直徑約1mm，另外在大量優(yōu)勢菌落中還夾雜少數(shù)綠色和菌落直徑約2mm的淺黃色菌落，均生長良好?；貧w感染后鑒定，將菌株1命名為090625，菌株2命名為070925。

2.3.2生理生化檢測再分離菌株經(jīng)自動微生物檢測儀GNI鑒定卡，結(jié)果見表1。其中，葡萄糖氧化、生長控制、蔗糖發(fā)酵等都顯陽性，具有典型的海洋弧菌生化特性。根據(jù)全自動細菌鑒定儀檢測結(jié)果，初步判斷這2種菌株均為海洋弧菌。

2.3.3分子生物學鑒定

以再分離菌株菌液為模板，利用PCR方法，擴增出2條大小為1000～2000bp的條帶。經(jīng)過測序，得出2條長度分別為1389、1477bp的DNA鏈（圖1、圖2）。BLAST程序搜索NCBI基因庫中所有已登錄的同源序列，結(jié)果顯示菌株090625的序列與哈維氏弧菌最為相似，同源性高達99%；而菌株070925的序列與副溶血弧菌最為相似，同源性也高達99%。據(jù)此確認菌株090625為哈維氏弧菌，菌株070925為副溶血弧菌，并將二者的16SrRNA部分序列上傳GenBank，登錄號分別為GQ327950、EU170469。

2.3.4大黃魚攻毒試驗結(jié)果

2.3.4.1體表病變情況分析

對大黃魚親魚（已注射催產(chǎn)素）和大黃魚幼魚同時進行攻毒試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攻毒后的大黃魚出現(xiàn)典型的海洋弧菌病灶。攻毒18h后，部分大黃魚親魚浮上水面，胸鰭、腹鰭、尾鰭、鰓蓋等部位均有出血癥狀，鱗片出現(xiàn)脫落（圖3）。

2.3.4.2大黃魚體內(nèi)各組織病變特征分析

通過解剖發(fā)現(xiàn)，大黃魚幼魚頭腎、肝臟等組織結(jié)構(gòu)清晰，保持較為完整狀態(tài)。但患病親魚的頭腎、肝臟等組織出現(xiàn)糜爛等癥狀（圖4）。

3結(jié)論與討論

菌種鑒定是一項繁瑣的工作。海洋細菌數(shù)量繁多、種類復雜，特別是同一屬菌株間性質(zhì)相似度較高，更增加了鑒定工作的難度。因此，通常須要同時采用多種儀器、生化指標、試驗手段，經(jīng)綜合測定分析后才能較準確鑒定細菌種類[8]。本

研究首先采用選擇性培養(yǎng)基TCBS進行病原菌培養(yǎng)。TCBS培養(yǎng)基上形成的菌落基本為黃色，其中含有少量綠色菌株。在TCBS培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，隆起，邊緣整齊，表現(xiàn)出海洋弧菌在TCBS培養(yǎng)基上生長的典型癥狀。培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)

菌株070925較為黏稠，與副溶血弧菌的特性相符[9]。哈維氏

弧菌在過夜培養(yǎng)時，培養(yǎng)溫度低于30℃時可以正常生長，而副溶血弧菌的培養(yǎng)溫度必須維持在30℃才能過夜培養(yǎng)，該結(jié)果與副溶血弧菌對低溫較為敏感的報道[10-12]一致。在生理生化水平方面，采用自動微生物檢測系統(tǒng)（AMS）和鑒定卡GNI進行菌種鑒定，結(jié)果表明2種病原菌均為海洋弧菌。另外，參照文獻中葡萄糖氧化、生長控制、蔗糖發(fā)酵等生化特征[13]，初步判斷這2種菌為海洋弧菌。最后根據(jù)16SrDNA序列確定為哈維氏弧菌（Vibrioharveyi）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）。

哈維氏弧菌和副溶血弧菌是條件性致病菌[14]。隨著養(yǎng)殖水域生態(tài)環(huán)境的惡化，海洋弧菌已成為引起魚類病害的主要致病菌之一。本研究通過人工感染發(fā)現(xiàn)，哈維氏弧菌和副溶血弧菌的混合菌液對大黃魚具有較強的毒力，針對不同體質(zhì)的大黃魚，其致病性有所不同。大黃魚親魚更容易感染細菌，同時顯示出較明顯的病癥，而對于幼魚而言，其致病性相對較弱。

本研究對2種海洋弧菌進行了鑒定，同時對2種不同生理狀態(tài)的大黃魚感染2種海洋弧菌的發(fā)病機制進行了初探，這為大黃魚人工繁育、親魚抗病力的研究提供了理論基礎，也為大黃魚免疫機制的深入研究奠定了基礎。

[HS2*3][HT8.5H]參考文獻：

[1]VezzulliL，PezzatiE，Huete-StaufferC，etal.16SrDNApyrosequencingofthemediterraneangorgonianParamuriceaclavatarevealsalinkamongalterationsinbacterialholobiontmembers，anthropogenicinfluenceanddiseaseoutbreaks[J].PLOSOne，2013，8（6）：e67745.

[2]DupontS，Carré-MloukaA，DescarregaF，etal.DiversityandbiologicalactivitiesofthebacterialcommunityassociatedwiththemarinespongePhorbastenacior（Porifera，Demospongiae）[J].LettersinAppliedMicrobiology，2014，58（1）：42-52.endprint

[3]NiuSF，JinY，XuX，etal.Characterizationofanovelpiscidin-likeantimicrobialpeptidefromPseudosciaenacroceaanditsimmuneresponsetoCryptocaryonirritans[J].Fish&ShellfishImmunology，2013，35（2）：513-524.

[4]閻斌倫，秦國民，暴增海，等.三疣梭子蟹病原副溶血弧菌的分離與鑒定[J].海洋通報，2010，29（5）：560-566.

[5]倪海兒，王國良.網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚潰瘍病的預報模型[J].水產(chǎn)學報，2009，33（2）：334-341.

[6]王軍，蘇永全，張朝霞，等.閩南地區(qū)養(yǎng)殖大黃魚細菌性疾病的病原生物學研究[J].廈門大學學報：自然科學版，2001，40（1）：85-91.

[7]衛(wèi)瑋.大黃魚對鰻弧菌減毒活疫苗免疫應答差異表達基因的篩選與鑒定[D].上海：華東理工大學，2010：58-60.

[8]覃映雪.養(yǎng)殖青石斑魚（Epinephlusawoara）潰瘍病細菌病原及其DNA疫苗的研究[D].廈門：廈門大學，2005：15-17.

[9]夏小安，吳清洋，李遠友，等.鋸緣青蟹混合感染癥致病菌的分離鑒定與感染治療[J].熱帶海洋學報，2010，29（5）：103-110.

[10]邱德全，藺紅蘋，譚龍艷.一株副溶血弧菌噬菌體生理特性的研究[J].微生物學通報，2007，34（4）：735-739.

[11]丁云娟，彭勇，林洪，等.一株副溶血弧菌噬菌體的分離鑒定及生理特性[J].[HJ2.1mm]微生物學通報，2011，38（11）：1639-1646.

[12]鐘琳紅，陳吉祥，姜瑩安，等.非可培養(yǎng)狀態(tài)哈維氏弧菌（Vibrioharveyi）復蘇后生理特征及毒力相關基因表達[J].海洋與湖沼，2010，41（3）：435-439.

[13]HoltJG.Bergeysmanualofdeterminativebacteriology[M].Ninthedition.Baltimore：WilliamsandWilkins，1993：345-367.

[14]AustinB，AustinDA.Bacterialfishpathogens：diseasesoffarmedandwildfish[M].4thed.Chichester：Springer-Praxis，2007：189-202.endprint

[3]NiuSF，JinY，XuX，etal.Characterizationofanovelpiscidin-likeantimicrobialpeptidefromPseudosciaenacroceaanditsimmuneresponsetoCryptocaryonirritans[J].Fish&ShellfishImmunology，2013，35（2）：513-524.

[4]閻斌倫，秦國民，暴增海，等.三疣梭子蟹病原副溶血弧菌的分離與鑒定[J].海洋通報，2010，29（5）：560-566.

[5]倪海兒，王國良.網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚潰瘍病的預報模型[J].水產(chǎn)學報，2009，33（2）：334-341.

[6]王軍，蘇永全，張朝霞，等.閩南地區(qū)養(yǎng)殖大黃魚細菌性疾病的病原生物學研究[J].廈門大學學報：自然科學版，2001，40（1）：85-91.

[7]衛(wèi)瑋.大黃魚對鰻弧菌減毒活疫苗免疫應答差異表達基因的篩選與鑒定[D].上海：華東理工大學，2010：58-60.

[8]覃映雪.養(yǎng)殖青石斑魚（Epinephlusawoara）潰瘍病細菌病原及其DNA疫苗的研究[D].廈門：廈門大學，2005：15-17.

[9]夏小安，吳清洋，李遠友，等.鋸緣青蟹混合感染癥致病菌的分離鑒定與感染治療[J].熱帶海洋學報，2010，29（5）：103-110.

[10]邱德全，藺紅蘋，譚龍艷.一株副溶血弧菌噬菌體生理特性的研究[J].微生物學通報，2007，34（4）：735-739.

[11]丁云娟，彭勇，林洪，等.一株副溶血弧菌噬菌體的分離鑒定及生理特性[J].[HJ2.1mm]微生物學通報，2011，38（11）：1639-1646.

[12]鐘琳紅，陳吉祥，姜瑩安，等.非可培養(yǎng)狀態(tài)哈維氏弧菌（Vibrioharveyi）復蘇后生理特征及毒力相關基因表達[J].海洋與湖沼，2010，41（3）：435-439.

[13]HoltJG.Bergeysmanualofdeterminativebacteriology[M].Ninthedition.Baltimore：WilliamsandWilkins，1993：345-367.

[14]AustinB，AustinDA.Bacterialfishpathogens：diseasesoffarmedandwildfish[M].4thed.Chichester：Springer-Praxis，2007：189-202.endprint

[3]NiuSF，JinY，XuX，etal.Characterizationofanovelpiscidin-likeantimicrobialpeptidefromPseudosciaenacroceaanditsimmuneresponsetoCryptocaryonirritans[J].Fish&ShellfishImmunology，2013，35（2）：513-524.

[4]閻斌倫，秦國民，暴增海，等.三疣梭子蟹病原副溶血弧菌的分離與鑒定[J].海洋通報，2010，29（5）：560-566.

[5]倪海兒，王國良.網(wǎng)箱養(yǎng)殖大黃魚潰瘍病的預報模型[J].水產(chǎn)學報，2009，33（2）：334-341.

[6]王軍，蘇永全，張朝霞，等.閩南地區(qū)養(yǎng)殖大黃魚細菌性疾病的病原生物學研究[J].廈門大學學報：自然科學版，2001，40（1）：85-91.

[7]衛(wèi)瑋.大黃魚對鰻弧菌減毒活疫苗免疫應答差異表達基因的篩選與鑒定[D].上海：華東理工大學，2010：58-60.

[8]覃映雪.養(yǎng)殖青石斑魚（Epinephlusawoara）潰瘍病細菌病原及其DNA疫苗的研究[D].廈門：廈門大學，2005：15-17.

[9]夏小安，吳清洋，李遠友，等.鋸緣青蟹混合感染癥致病菌的分離鑒定與感染治療[J].熱帶海洋學報，2010，29（5）：103-110.

[10]邱德全，藺紅蘋，譚龍艷.一株副溶血弧菌噬菌體生理特性的研究[J].微生物學通報，2007，34（4）：735-739.

[11]丁云娟，彭勇，林洪，等.一株副溶血弧菌噬菌體的分離鑒定及生理特性[J].[HJ2.1mm]微生物學通報，2011，38（11）：1639-1646.

[12]鐘琳紅，陳吉祥，姜瑩安，等.非可培養(yǎng)狀態(tài)哈維氏弧菌（Vibrioharveyi）復蘇后生理特征及毒力相關基因表達[J].海洋與湖沼，2010，41（3）：435-439.

[13]HoltJG.Bergeysmanualofdeterminativebacteriology[M].Ninthedition.Baltimore：WilliamsandWilkins，1993：345-367.

[14]AustinB，AustinDA.Bacterialfishpathogens：diseasesoffarmedandwildfish[M].4thed.Chichester：Springer-Praxis，2007：189-202.endprint