李光+龔寧

摘要：對生長一致的金線蘭組培苗進行干旱脅迫試驗，采用分光光度法和同工酶電泳技術分別研究了干旱脅迫期間金線蘭POD活性及同工酶酶譜的變化。結(jié)果表明：干旱脅迫下，金線蘭POD活性呈現(xiàn)“M”形的變化規(guī)律，同工酶條帶數(shù)量發(fā)生改變，在脅迫的前2d，在“-”區(qū)產(chǎn)生4條新的酶帶，表明在干旱脅迫下，金線蘭試管苗迅速誘導POD新酶帶以適應脅迫環(huán)境。脅迫3d，酶帶條數(shù)減少到5條，與此同時POD活性也降到最低。從脅迫后4d起，在“+”區(qū)產(chǎn)生2條新的酶帶。這可能是POD同工酶的表達基因有部分關閉或開啟，導致酶帶條數(shù)的增減。

關鍵詞：干旱脅迫；金線蘭；同工酶酶譜

中圖分類號：Q945.78文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0208-02

干旱脅迫導致植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，活性氧可以導致蛋白質(zhì)、膜脂、DNA及其他細胞組分嚴重損傷[1-3]。在植物的抗氧化酶系統(tǒng)中，POD能將H2O2分解為無害的H2O和O2，降低細胞內(nèi)活性氧的濃度，對維持植物正常的生理功能具有重要意義[4-6]。金線蘭[Anoectochilusroxburghii（Wall.）Lindl]，別名花葉開唇蘭，為蘭科開唇蘭屬植物[7]，生活在陰濕環(huán)境中，干旱脅迫對金線蘭的傷害較其他逆境嚴重。目前，金線蘭組培快繁已經(jīng)取得成功，已經(jīng)進行工廠化生產(chǎn)，但是有關金線蘭組培苗抗旱的研究鮮見報道，本試驗對干旱脅迫下金線蘭的POD活性和同工酶變化進行研究，為進一步了解干旱脅迫條件下金線蘭的生理響應機制提供參考。

1材料與方法

1.1材料

材料為生長一致的金線蘭組培苗，由貴州師范大學生命科學學院培養(yǎng)室提供。

1.2方法

取出金線蘭組培苗，無菌水將幼根沖洗干凈，放入MS營養(yǎng)液中適應性培養(yǎng)3d，再移入含不同濃度PEG6000的溶液中進行根際干旱脅迫處理。PEG6000的干旱脅迫設4個濃度處理：10%（處理Ⅰ）、20%（處理Ⅱ）、30%（處理Ⅲ）、40%（處理Ⅳ），每種處理重復3次。同工酶分析選擇20%PEG6000處理的金線蘭組培苗，培養(yǎng)溫度為（23±2）℃，每天光照12h（08：00—20：00），光照強度為3000lx。

1.2.1粗酶液的制備準確稱取成熟鮮葉0.50g，加入預冷的酶提取液（50mmol/LpH值7.8磷酸緩沖液內(nèi)含0.1mmol/LEDTA，0.3%TritonX-100，4%PVP）5mL，冰浴充分研磨，于冷凍離心機（4℃）12000r/min離心20min，上清液即為粗酶液，冷藏備用。

1.2.2過氧化物酶（POD）活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[8]，3.0mL反應混合液（50.0mmol/L磷酸緩沖液500mL中含0.28mL愈創(chuàng)木酚和30%的H2O20.19mL）中加入50.0μL酶液，迅速搖勻，測D470nm。每30s讀數(shù)1次，以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，單位為U/（min·g）。

1.2.3電泳

1.2.3.1加樣

濃縮膠聚合之后，小心拔出梳子，用濾紙條吸干梳孔中的水分，并注入預冷已稀釋10倍的電極緩沖液。從冰箱冷凍室中取出樣品，4℃下解凍，待樣品解凍后，用微量進樣器吸取80.0μL酶液，小心注入梳孔底部，同時記錄樣品號和相應的樣品槽號，加入1滴0.1%的溴酚藍指示劑。將電泳槽小心移入4℃冰箱中電泳。電泳條件：120min前電泳電壓100B，120min后電泳電壓200B，電泳時間22h。

1.2.3.2過氧化物同工酶染色

膠電泳完畢并經(jīng)雙蒸水沖洗3次后，在染液（0.1g聯(lián)苯胺，5.0mL無水乙醇，10.0mL1.5mol/L乙酸鈉，10.0mL1.5mol/L乙酸）中加入6～10滴30%的H2O2，迅速搖勻后倒在凝膠上，并將染色盒置于水平搖床上，室溫下輕微搖動。待橙黃色酶帶完全出現(xiàn)（約15min）后，倒出染色液，自來水沖洗，數(shù)碼相機拍照后放入7%乙酸中保存。

2結(jié)果與分析

2.1干旱脅迫對金線蘭組培苗葉片過氧化物酶（POD）的影響

由圖1可知，干旱脅迫下不同處理葉片POD活性總體上呈現(xiàn)“M”形的變化規(guī)律，處理1在處理后2d，達到第1個峰值，達152.94U/（min·g），脅迫3～4d逐步降低，脅迫5～6d再次升高，到脅迫6d達第2個峰值。處理2、處理3、處理4的第1個峰值在脅迫3d出現(xiàn)。脅迫3～5d逐步降低，脅迫5d達最低，脅迫6d又迅速升高，達第2個峰值，脅迫7d再次下降。各處理第1次的峰值大于第2次的峰值，第1次峰值的大小順序依次為：處理2[298.098U/（min·g）]>處理4[232.888U/（min·g）]>處理3[195.584U/（min·g）]>處理1[152.941U/（min·g）]?？梢?，金線蘭對不同濃度的PEG6000干旱脅迫處理影響存在很大差異，其中20%的PEG6000處理，POD活性上升最高，因而選取這一濃度處理用于后續(xù)同工酶分析。

2.2組培苗過氧化物同工酶分析

組培苗POD同工酶電泳結(jié)果見圖2。從圖2可見過氧化物同工酶譜帶共11條。隨著干旱脅迫時間的延長，酶帶表現(xiàn)一定的變化。脅迫1～2d，在“-”區(qū)產(chǎn)生4條新的酶帶，表明在干旱脅迫下，金線蘭試管苗迅速誘導POD新酶帶產(chǎn)生以適應脅迫環(huán)境。脅迫3d，酶帶條數(shù)減少到5條，與此同時POD活性也降到最低。脅迫4d起，在“+”區(qū)產(chǎn)生2條新的酶帶，表明在干旱脅迫過程中，金線蘭可能通過2種響應途徑產(chǎn)生POD同工酶。

3結(jié)論

水分是植物的重要組成部分，是植物賴以生存的必要條件之一，無論是長期干旱還是短時間的水分虧缺都可能對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生不同程度的影響。近年來，國內(nèi)外學者對植物抗旱機理作了大量研究，取得了較好的研究成果，但是金線蘭分布范圍較窄，長期以來人們多關注于金線蘭的藥效研究，對于其抗旱性研究較少。周黎等以3種不同來源的金線蘭組培苗（種子苗、根狀莖苗、地上莖苗）為試驗材料，研究金線蘭組培苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在土壤干旱脅迫下的變化規(guī)律[9]，但是他們僅僅研究了可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和游離脯氨酸受干旱脅迫后的變化情況，未提及POD在干逆脅迫條件下的變化情況。POD是重要的抗旱相關酶，對金線蘭干旱脅迫下POD活性及同工酶帶的變化進行研究具有重要的意義。

本研究結(jié)果表明，在持續(xù)干旱脅迫下，金線蘭POD同工酶的電泳條帶發(fā)生變化，即在干旱脅迫處理1～2d，金線蘭POD同工酶的酶帶數(shù)量逐漸增加，脅迫2d酶帶數(shù)量達到最大。脅迫3d酶帶數(shù)量急劇減少到最少，脅迫4～6d的酶帶數(shù)量有所回升，這個變化與金線蘭POD活性的變化基本一致?？赡艿脑蚴?，在干旱脅迫的過程中，由于金線蘭POD同工酶的部分酶帶前體的活化，產(chǎn)生了新的酶帶，這可能是在干旱脅迫下，金線蘭POD酶帶在脅迫1～2d有所增加的原因。隨著脅迫時間的延長，酶發(fā)生了降解或部分降解，導致部分酶帶消失或變淺，這可能就是干旱脅迫4dPOD同工酶酶帶減少至最少的原因。而后3dPOD酶帶有所增加，這可能是金線蘭在受到較長時間的干旱脅迫后啟動了新的POD的機制。由于POD較易失活，金線蘭POD同工酶酶帶的變化也可能完全是由相關基因的關閉和開啟造成的，即在干旱脅迫的初期，金線蘭迅速打開應急機制增加POD含量，隨著脅迫的持續(xù)，金線蘭增加POD含量的應急機制逐漸失效，導致脅迫3dPOD酶帶減少至最少，脅迫5～7d金線蘭POD酶帶的增加，可能是由于金線蘭啟動了抵抗干旱脅迫的長效機制。然而金線蘭在干旱脅迫條件下POD活性及酶帶的變化究竟是由哪種機制調(diào)控的，需要進一步分子生物學的研究，以深入了解干旱脅迫下金線蘭POD相關基因表達的變化情況。

參考文獻：

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[9]周黎，龔寧，彭健.干旱脅迫下金線蘭滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化規(guī)律[J].貴州科學，2008，26（4）：68-71.

本研究結(jié)果表明，在持續(xù)干旱脅迫下，金線蘭POD同工酶的電泳條帶發(fā)生變化，即在干旱脅迫處理1～2d，金線蘭POD同工酶的酶帶數(shù)量逐漸增加，脅迫2d酶帶數(shù)量達到最大。脅迫3d酶帶數(shù)量急劇減少到最少，脅迫4～6d的酶帶數(shù)量有所回升，這個變化與金線蘭POD活性的變化基本一致。可能的原因是，在干旱脅迫的過程中，由于金線蘭POD同工酶的部分酶帶前體的活化，產(chǎn)生了新的酶帶，這可能是在干旱脅迫下，金線蘭POD酶帶在脅迫1～2d有所增加的原因。隨著脅迫時間的延長，酶發(fā)生了降解或部分降解，導致部分酶帶消失或變淺，這可能就是干旱脅迫4dPOD同工酶酶帶減少至最少的原因。而后3dPOD酶帶有所增加，這可能是金線蘭在受到較長時間的干旱脅迫后啟動了新的POD的機制。由于POD較易失活，金線蘭POD同工酶酶帶的變化也可能完全是由相關基因的關閉和開啟造成的，即在干旱脅迫的初期，金線蘭迅速打開應急機制增加POD含量，隨著脅迫的持續(xù)，金線蘭增加POD含量的應急機制逐漸失效，導致脅迫3dPOD酶帶減少至最少，脅迫5～7d金線蘭POD酶帶的增加，可能是由于金線蘭啟動了抵抗干旱脅迫的長效機制。然而金線蘭在干旱脅迫條件下POD活性及酶帶的變化究竟是由哪種機制調(diào)控的，需要進一步分子生物學的研究，以深入了解干旱脅迫下金線蘭POD相關基因表達的變化情況。

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本研究結(jié)果表明，在持續(xù)干旱脅迫下，金線蘭POD同工酶的電泳條帶發(fā)生變化，即在干旱脅迫處理1～2d，金線蘭POD同工酶的酶帶數(shù)量逐漸增加，脅迫2d酶帶數(shù)量達到最大。脅迫3d酶帶數(shù)量急劇減少到最少，脅迫4～6d的酶帶數(shù)量有所回升，這個變化與金線蘭POD活性的變化基本一致?？赡艿脑蚴?，在干旱脅迫的過程中，由于金線蘭POD同工酶的部分酶帶前體的活化，產(chǎn)生了新的酶帶，這可能是在干旱脅迫下，金線蘭POD酶帶在脅迫1～2d有所增加的原因。隨著脅迫時間的延長，酶發(fā)生了降解或部分降解，導致部分酶帶消失或變淺，這可能就是干旱脅迫4dPOD同工酶酶帶減少至最少的原因。而后3dPOD酶帶有所增加，這可能是金線蘭在受到較長時間的干旱脅迫后啟動了新的POD的機制。由于POD較易失活，金線蘭POD同工酶酶帶的變化也可能完全是由相關基因的關閉和開啟造成的，即在干旱脅迫的初期，金線蘭迅速打開應急機制增加POD含量，隨著脅迫的持續(xù)，金線蘭增加POD含量的應急機制逐漸失效，導致脅迫3dPOD酶帶減少至最少，脅迫5～7d金線蘭POD酶帶的增加，可能是由于金線蘭啟動了抵抗干旱脅迫的長效機制。然而金線蘭在干旱脅迫條件下POD活性及酶帶的變化究竟是由哪種機制調(diào)控的，需要進一步分子生物學的研究，以深入了解干旱脅迫下金線蘭POD相關基因表達的變化情況。

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