徐艷+江建敏+國(guó)駿+紀(jì)明山

摘要：通過(guò)液體發(fā)酵培養(yǎng)獲得黃瓜褐斑病菌菌絲，再經(jīng)反復(fù)凍融法獲得菌絲蛋白，研究不同濃度菌絲蛋白對(duì)小麥種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白能顯著促進(jìn)小麥種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)，具有激活蛋白的功能。不同濃度菌絲蛋白對(duì)小麥種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用不同，其中以0.625mg/mL菌絲蛋白對(duì)小麥種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最明顯：種子萌發(fā)率從70%提高到85%；處理5、7、9、11d幼苗株高與對(duì)照組相比分別提高25%、50%、58%、45%。小麥抗旱性誘導(dǎo)作用也以0.625mg/mL菌絲蛋白處理的小麥最佳，與對(duì)照相比，幼苗存活率提高21.28百分點(diǎn)，抗衰度提高19.58百分點(diǎn)，苗抗旱綜合系數(shù)從35.45提高到55.88，是對(duì)照的1.57倍，根系活力是對(duì)照的2倍。

關(guān)鍵詞：黃瓜褐斑?。痪z蛋白；激活蛋白；種子萌發(fā)；生長(zhǎng)；抗旱性；小麥

中圖分類(lèi)號(hào)：S512.101文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0159-02

激活蛋白是一類(lèi)從真菌中分離的、具有激發(fā)子功能的新型蛋白質(zhì)。激活蛋白主要通過(guò)激活植物體內(nèi)分子免疫系統(tǒng)，提高植物自身免疫力，激發(fā)植物體內(nèi)的一系列代謝調(diào)控，促進(jìn)植物根、莖、葉生長(zhǎng)和葉綠素含量提高，從而達(dá)到提高作物產(chǎn)量的目的[1]?；蛐酒治鼋Y(jié)果表明，激活蛋白處理后，水稻一系列與防御和生長(zhǎng)相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)[2]。激活蛋白能誘導(dǎo)多種植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，改善作物品質(zhì)。激活蛋白在交鏈孢菌（Alternariasp.）、紋枯病菌（Rhizoctoniasolani）、黃曲霉菌（Aspergillussp.）、稻瘟菌（Magnaportegrisea）、青霉菌（Penicilliumsp.）、木霉菌（Trichodermasp.）、鐮刀菌（Fusariumsp.）等多種真菌中都有發(fā)現(xiàn)[3]，不同來(lái)源的蛋白激發(fā)子在理化性質(zhì)上略有差異，但生物活性相似。為進(jìn)一步發(fā)掘具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型激活蛋白，本研究以黃瓜褐斑病菌為試驗(yàn)材料，通過(guò)液體發(fā)酵獲得菌絲，低溫提取其蛋白，研究其生物功能。

1材料與方法

1.1主要材料和儀器

黃瓜褐斑病菌由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室提供。

離心機(jī)，恒溫水浴鍋，電子天平，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，真空干燥箱，培養(yǎng)皿（直徑90mm），自動(dòng)恒溫箱。

1.2方法

1.2.1黃瓜褐斑病菌菌絲體的培養(yǎng)

用接種針挑取少許黃瓜褐斑病菌菌絲，接種到PDA固體培養(yǎng)基上，放置在培養(yǎng)箱中28℃恒溫培養(yǎng)7d后，取直徑1cm的固體培養(yǎng)菌塊接種到200mLYPD液體培養(yǎng)基中，于28℃恒溫振蕩培養(yǎng)4～5d，真空抽濾收集菌絲體，用雙蒸水反復(fù)洗滌4次，低溫干燥。

1.2.2黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白的獲得

取黃瓜褐斑病菌菌絲體10g，用粉碎機(jī)粉碎，置于燒杯中于-25℃反復(fù)凍融2次，在高速冷凍離心機(jī)上12000r/min離心15min，收集上清，冷凍干燥，凍存于-20℃冰箱中備用。

1.2.3黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線：取牛血清白蛋白，配制成濃度1mg/mL，用蒸餾水分別稀釋成濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL。準(zhǔn)確吸取所配各管溶液0.1mL，分別放入具塞試管中，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，混勻，放置2min后，在595nm處測(cè)定吸光度。

菌絲蛋白含量測(cè)定：稱取菌絲蛋白，用蒸餾水配制成濃度梯度。分別量取上述溶液0.1mL并放入20mL具塞試管中，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，將試管中溶液緩慢混合均勻，放置2min后，在595nm處測(cè)定吸光度。

1.2.4黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白對(duì)小麥種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響[4-5]

取籽粒飽滿的小麥種子，消毒后用不同濃度菌絲蛋白浸種8h，每處理20粒種子，置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，以蒸餾水為對(duì)照，12h后記錄發(fā)芽率，于培養(yǎng)5、7、9、11d時(shí)測(cè)量株高。

1.2.5黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白對(duì)小麥抗旱性誘導(dǎo)作用的影響[6]

取健康飽滿的小麥種子，消毒后用不同濃度菌絲蛋白浸種8h，每處理20粒種子置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，然后加入60g石英砂，以蒸餾水為對(duì)照，適時(shí)補(bǔ)水。小麥生長(zhǎng)14d時(shí)停止補(bǔ)水，進(jìn)行干旱脅迫，當(dāng)70%植株萎蔫、葉片卷成針狀時(shí)復(fù)水，再次干旱脅迫后，再?gòu)?fù)水，1d后統(tǒng)計(jì)幼苗存活率和葉片抗衰度，計(jì)算幼苗抗旱綜合系數(shù)。各處理均重復(fù)3次。

幼苗存活率=（第1次干旱脅迫后存活株數(shù)/第1次干旱脅迫前株數(shù)+第2次干旱脅迫后存活株數(shù)/第1次干旱脅迫后存活株數(shù)）×0.5×100%；

葉片抗衰度=（葉片綠色段長(zhǎng)/葉片全長(zhǎng)）×100%；

幼苗抗旱綜合系數(shù)=（幼苗存活率+葉片抗衰度）×100/2。

1.2.6黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白對(duì)小麥植株根系活力的影響[7]

采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測(cè)定根系活力。稱取根尖樣品0.5g，放入小燒杯中，加入0.4%TTC溶液和66mmol/LpH值7.0的磷酸緩沖液的等量混合液10mL，把根充分浸沒(méi)在溶液內(nèi)，在37℃下暗保溫1～3h，此后加入1mol/L硫酸2mL，停止反應(yīng)。與此同時(shí)做一空白試驗(yàn)，先加硫酸，再加根樣品，其他操作同上。然后把根取出，吸干水分后與乙酸乙酯或丙酮3～4mL和少量石英砂一起在研缽內(nèi)磨碎，以提取三苯基甲腙。將紅色提取液移入試管，并用少量乙酸乙酯或丙酮把殘?jiān)礈?次，皆移入試管，最后加乙酸乙酯或丙酮使總量為10mL，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)485nm下比色，以空白試驗(yàn)作參比測(cè)出吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出TTC的還原量。

TTC還原強(qiáng)度=TTC還原量（g）/[根重（g）×?xí)r間（h）]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取0.4%TTC溶液0.2mL放入10mL量瓶中，加少許Na2S2O4粉末搖勻后立即產(chǎn)生紅色的三苯基甲腙，再用乙酸乙酯或丙酮定容至刻度，搖勻。然后分別取該液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mL置于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得含三苯基甲腙25、50、100、150、200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)比色系列，以空白作參比，在485nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白對(duì)小麥種子萌發(fā)的影響

由圖1可以看出，與對(duì)照相比，黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白能顯著促進(jìn)小麥種子萌發(fā)。不同濃度菌絲蛋白浸泡過(guò)的小麥種子萌發(fā)率均高于對(duì)照，其中以0.625mg/mL菌絲蛋白對(duì)小麥生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最明顯，種子萌發(fā)率從70%提高到85%。

2.2黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白對(duì)小麥生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，經(jīng)菌絲蛋白液處理后，小麥的生長(zhǎng)速率也明

顯提高，幼苗生長(zhǎng)旺盛，株高明顯高于對(duì)照，其中以0.625mg/mL菌絲蛋白對(duì)小麥種子生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最顯著，處理5、7、9、11d幼苗株高與對(duì)照相比分別提高25%、5%、58%、45%。

2.3黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白對(duì)小麥誘導(dǎo)抗旱性及根系活力的影響

對(duì)小麥進(jìn)行干旱脅迫后，對(duì)照組的小麥大部分萎蔫，而菌絲蛋白組處理的小麥生長(zhǎng)良好，保持直立狀態(tài)。其中以0.625mg/mL菌絲蛋白對(duì)小麥抗旱性作用最顯著，干旱復(fù)水后，0.625mg/mL菌絲蛋白處理的小麥幼苗存活率比對(duì)照提高21.28百分點(diǎn)，抗衰度比對(duì)照提高19.58百分點(diǎn)，幼苗抗旱綜合系數(shù)從35.45提高到55.88，是對(duì)照的1.57倍，根系活力是對(duì)照的2倍（表1），說(shuō)明黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白增強(qiáng)了小麥的抗旱性。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白對(duì)小麥種子萌發(fā)及生長(zhǎng)表現(xiàn)為促進(jìn)作用，具有激活蛋白的功能。經(jīng)過(guò)0.625mg/mL菌絲蛋白處理過(guò)的小麥種子生長(zhǎng)最好，并且能夠增強(qiáng)小麥的抗旱性。

本試驗(yàn)僅研究了單一的作物小麥，而激活蛋白的應(yīng)用范圍很廣，因此它對(duì)其他作物（如黃瓜、番茄等）的影響可作進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)研究了激活蛋白對(duì)小麥種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響，僅僅驗(yàn)證了其促進(jìn)萌發(fā)、促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)及抗旱功效，而激活蛋白的功能還很多，可作進(jìn)一步研究。本研究所用黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白僅為粗蛋白，有必要繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行分離純化獲得活性物質(zhì)并進(jìn)行進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]邱德文.植物用多功能真菌蛋白質(zhì)：中國(guó)，0112866.0[P].2002-04-17.

[2]趙利輝，邱德文，劉崢，等.植物激活蛋白對(duì)水稻抗性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（7）：1358-1363.

[3]黃麗俊，邱德文，劉崢，等.應(yīng)用表達(dá)譜基因芯片篩選植物激活蛋白處理水稻相關(guān)差異基因[J].科學(xué)技術(shù)與工程，2005，5（24）：1885-1889.

[4]張志剛，[HJ2.1mm]邱德文，楊秀芬，等.新型激活蛋白對(duì)棉花種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的影響[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，18（3）：1-5.

[5]徐鋒，楊勇，謝馥交，等.稻瘟菌激活蛋白對(duì)植物生長(zhǎng)及其生理活性的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，21（5）：1-5.

[6]張?jiān)迫A.灰葡萄孢菌激活蛋白的純化、基因克隆與功能研究[D].沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[7]張志良，瞿偉.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，2003：277-278.

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取0.4%TTC溶液0.2mL放入10mL量瓶中，加少許Na2S2O4粉末搖勻后立即產(chǎn)生紅色的三苯基甲腙，再用乙酸乙酯或丙酮定容至刻度，搖勻。然后分別取該液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mL置于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得含三苯基甲腙25、50、100、150、200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)比色系列，以空白作參比，在485nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白對(duì)小麥種子萌發(fā)的影響

由圖1可以看出，與對(duì)照相比，黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白能顯著促進(jìn)小麥種子萌發(fā)。不同濃度菌絲蛋白浸泡過(guò)的小麥種子萌發(fā)率均高于對(duì)照，其中以0.625mg/mL菌絲蛋白對(duì)小麥生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最明顯，種子萌發(fā)率從70%提高到85%。

2.2黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白對(duì)小麥生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，經(jīng)菌絲蛋白液處理后，小麥的生長(zhǎng)速率也明

顯提高，幼苗生長(zhǎng)旺盛，株高明顯高于對(duì)照，其中以0.625mg/mL菌絲蛋白對(duì)小麥種子生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最顯著，處理5、7、9、11d幼苗株高與對(duì)照相比分別提高25%、5%、58%、45%。

2.3黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白對(duì)小麥誘導(dǎo)抗旱性及根系活力的影響

對(duì)小麥進(jìn)行干旱脅迫后，對(duì)照組的小麥大部分萎蔫，而菌絲蛋白組處理的小麥生長(zhǎng)良好，保持直立狀態(tài)。其中以0.625mg/mL菌絲蛋白對(duì)小麥抗旱性作用最顯著，干旱復(fù)水后，0.625mg/mL菌絲蛋白處理的小麥幼苗存活率比對(duì)照提高21.28百分點(diǎn)，抗衰度比對(duì)照提高19.58百分點(diǎn)，幼苗抗旱綜合系數(shù)從35.45提高到55.88，是對(duì)照的1.57倍，根系活力是對(duì)照的2倍（表1），說(shuō)明黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白增強(qiáng)了小麥的抗旱性。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白對(duì)小麥種子萌發(fā)及生長(zhǎng)表現(xiàn)為促進(jìn)作用，具有激活蛋白的功能。經(jīng)過(guò)0.625mg/mL菌絲蛋白處理過(guò)的小麥種子生長(zhǎng)最好，并且能夠增強(qiáng)小麥的抗旱性。

本試驗(yàn)僅研究了單一的作物小麥，而激活蛋白的應(yīng)用范圍很廣，因此它對(duì)其他作物（如黃瓜、番茄等）的影響可作進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)研究了激活蛋白對(duì)小麥種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響，僅僅驗(yàn)證了其促進(jìn)萌發(fā)、促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)及抗旱功效，而激活蛋白的功能還很多，可作進(jìn)一步研究。本研究所用黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白僅為粗蛋白，有必要繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行分離純化獲得活性物質(zhì)并進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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[3]黃麗俊，邱德文，劉崢，等.應(yīng)用表達(dá)譜基因芯片篩選植物激活蛋白處理水稻相關(guān)差異基因[J].科學(xué)技術(shù)與工程，2005，5（24）：1885-1889.

[4]張志剛，[HJ2.1mm]邱德文，楊秀芬，等.新型激活蛋白對(duì)棉花種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的影響[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，18（3）：1-5.

[5]徐鋒，楊勇，謝馥交，等.稻瘟菌激活蛋白對(duì)植物生長(zhǎng)及其生理活性的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，21（5）：1-5.

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標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取0.4%TTC溶液0.2mL放入10mL量瓶中，加少許Na2S2O4粉末搖勻后立即產(chǎn)生紅色的三苯基甲腙，再用乙酸乙酯或丙酮定容至刻度，搖勻。然后分別取該液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00mL置于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得含三苯基甲腙25、50、100、150、200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)比色系列，以空白作參比，在485nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

2結(jié)果與分析

2.1黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白對(duì)小麥種子萌發(fā)的影響

由圖1可以看出，與對(duì)照相比，黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白能顯著促進(jìn)小麥種子萌發(fā)。不同濃度菌絲蛋白浸泡過(guò)的小麥種子萌發(fā)率均高于對(duì)照，其中以0.625mg/mL菌絲蛋白對(duì)小麥生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最明顯，種子萌發(fā)率從70%提高到85%。

2.2黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白對(duì)小麥生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，經(jīng)菌絲蛋白液處理后，小麥的生長(zhǎng)速率也明

顯提高，幼苗生長(zhǎng)旺盛，株高明顯高于對(duì)照，其中以0.625mg/mL菌絲蛋白對(duì)小麥種子生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最顯著，處理5、7、9、11d幼苗株高與對(duì)照相比分別提高25%、5%、58%、45%。

2.3黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白對(duì)小麥誘導(dǎo)抗旱性及根系活力的影響

對(duì)小麥進(jìn)行干旱脅迫后，對(duì)照組的小麥大部分萎蔫，而菌絲蛋白組處理的小麥生長(zhǎng)良好，保持直立狀態(tài)。其中以0.625mg/mL菌絲蛋白對(duì)小麥抗旱性作用最顯著，干旱復(fù)水后，0.625mg/mL菌絲蛋白處理的小麥幼苗存活率比對(duì)照提高21.28百分點(diǎn)，抗衰度比對(duì)照提高19.58百分點(diǎn)，幼苗抗旱綜合系數(shù)從35.45提高到55.88，是對(duì)照的1.57倍，根系活力是對(duì)照的2倍（表1），說(shuō)明黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白增強(qiáng)了小麥的抗旱性。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白對(duì)小麥種子萌發(fā)及生長(zhǎng)表現(xiàn)為促進(jìn)作用，具有激活蛋白的功能。經(jīng)過(guò)0.625mg/mL菌絲蛋白處理過(guò)的小麥種子生長(zhǎng)最好，并且能夠增強(qiáng)小麥的抗旱性。

本試驗(yàn)僅研究了單一的作物小麥，而激活蛋白的應(yīng)用范圍很廣，因此它對(duì)其他作物（如黃瓜、番茄等）的影響可作進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)研究了激活蛋白對(duì)小麥種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響，僅僅驗(yàn)證了其促進(jìn)萌發(fā)、促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)及抗旱功效，而激活蛋白的功能還很多，可作進(jìn)一步研究。本研究所用黃瓜褐斑病菌菌絲蛋白僅為粗蛋白，有必要繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行分離純化獲得活性物質(zhì)并進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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[4]張志剛，[HJ2.1mm]邱德文，楊秀芬，等.新型激活蛋白對(duì)棉花種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的影響[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，18（3）：1-5.

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[7]張志良，瞿偉.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，2003：277-278.