王鑫+孔祥生

摘要：以流蘇樹愈傷組織為材料，測定其在不同濃度（0、50、100、150、200mmol/L）NaCl脅迫下的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛（MDA）含量和過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性。結(jié)果顯示：可溶性糖和脯氨酸含量先下降后上升，其中50mmol/LNaCl處理組的流蘇樹愈傷組織中的可溶性糖和脯氨酸含量均低于對照組；可溶性蛋白含量整體上先升高再下降；MDA含量初期迅速升高，中后期緩慢下降，對照組持續(xù)下降；SOD活性表現(xiàn)為迅速增強后稍有減弱；POD活性初期明顯減弱，中后期明顯增強，對照組變化較處理組不明顯。

關鍵詞：流蘇樹；愈傷組織；鹽脅迫；生理生化特征

中圖分類號：Q945.78文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0054-04

流蘇樹（Chionanthusretusus）別稱蘿卜絲花、茶葉樹、四月雪等，是木犀科流蘇樹屬落葉喬木，為國家二級保護植物，主要分布于我國甘肅、陜西、山西、河北、河南以南至云南、四川、廣東、福建、臺灣等地。流蘇樹的嫩葉及花可代茶，并具有一定藥用價值；材質(zhì)較好，可制器具和供細木工用；枝葉繁茂，花大而美麗，是優(yōu)良造林和觀賞樹種；果實含油率高，是一種重要能源植物[1]。但是目前關于流蘇樹的研究很少，關于組織培養(yǎng)的抗性研究還從未報道。流蘇樹用途廣泛但卻未被開發(fā)利用，與其傳統(tǒng)的繁殖方式不無關系。迄今為止，還沒有關于流蘇樹快速繁殖的研究，而且流蘇樹大部分分布于我國鹽堿地帶，所以選育耐鹽品種對其廣泛栽培和充分研究利用很有必要。植株和愈傷組織的耐鹽性相似，植株的耐鹽性可以在組織水平上表達，應用愈傷組織篩選耐鹽性是可行的[2]。滲透脅迫是指環(huán)境的低水勢對植物體產(chǎn)生的水分脅迫，包括干旱、鹽漬脅迫，可見鹽脅迫屬于滲透脅迫的一種。在滲透脅迫下，植物細胞失水，膨壓減小，生理活性減弱，嚴重時細胞完全喪失膨壓，最后導致細胞死亡。在一定范圍內(nèi)，某些植物細胞可通過自身滲透調(diào)節(jié)作用抵御外界滲透脅迫。滲透調(diào)節(jié)是植物適應滲透脅迫的生理生化機制，它通過主動增加細胞內(nèi)溶質(zhì)的作用降低滲透勢來促進細胞吸水，從而維持細胞膨壓。滲透調(diào)節(jié)是在細胞水平上進行的，即由細胞通過合成和吸收積累對細胞無害的溶質(zhì)來完成。參與細胞滲透調(diào)節(jié)的物質(zhì)主要有2類：一類是由外界引入細胞中的無機離子，一類是在細胞內(nèi)合成的有機溶質(zhì)，主要是可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、甜菜堿等[3-4]。鹽脅迫破壞植物體內(nèi)的氧化還原平衡，從而導致活性氧積累[5]、膜脂過氧化水平增高、丙二醛（MDA）含量增加[6]。MDA是膜質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，它能與膜上的蛋白質(zhì)、酶等結(jié)合，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)，使之失活，加劇膜質(zhì)過氧化作用，其積累是毒害作用的表現(xiàn)，人們常以其作為判斷膜質(zhì)過氧化作用的一個指標[7-8]。在NaCl脅迫下，細胞內(nèi)自由基代謝平衡失調(diào)而產(chǎn)生過剩的活性氧，會引起或加劇膜脂質(zhì)過氧化，造成細胞膜系統(tǒng)損傷，膜透性增強[9]。抗氧化脅迫是植物耐鹽的一種方式，保護酶系統(tǒng)[過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）]是防御活性氧及其他自由基對細胞膜系統(tǒng)傷害的重要酶[10]。本研究探討不同濃度（0、50、100、150、200mmol/L）NaCl脅迫下流蘇樹愈傷組織中可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸、MDA含量和POD、SOD活性的變化，分析流蘇樹在鹽脅迫下的生理生化特點，旨在為關于流蘇樹的其他研究奠定一定基礎。

1材料與方法

1.1材料和鹽脅迫處理

1.1.1無菌體系的建立

把采于河南省欒川縣獅子廟鄉(xiāng)的流蘇樹種子帶回實驗室，去除果皮和種皮，取出胚放于超凈工作臺上，用75%乙醇表面處理30s，無菌水沖洗3次，0.1%氯化汞溶液處理2min后取出，無菌水振蕩沖洗5次，無菌濾紙吸干表面水分，接種于添加了0.05mg/LNAA、1.0mg/LGA3、2.0mg/L6-BA、蔗糖30g/L、瓊脂6g/L的WPM培養(yǎng)基（pH值5.8）上暗培養(yǎng)4d，然后轉(zhuǎn)至光培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照時間12h/d，光照強度1500～2000lx，獲得無菌苗。

1.1.2愈傷組織的獲得

將萌發(fā)的無菌苗在超凈工作臺內(nèi)取出，將萌發(fā)變綠的子葉取下，切成0.5cm左右的塊狀，接種于添加了0.5mg/LNAA、0.5mg/L2，4-D、0.5mg/L6-BA、蔗糖30g/L、瓊脂6g/L的WPM培養(yǎng)基（pH值5.8）上光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照時間12h/d，光照強度1500～2000lx，培養(yǎng)20d后生成較好的愈傷組織。

1.1.3鹽脅迫處理

以WPM+0.5mg/LNAA+0.5mg/L2，4-D+0.5mg/L6-BA+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基，分別添加NaCl溶液，使其在培養(yǎng)基中的濃度分別達到50、100、150、200mmol/L，并以不添加NaCl溶液為對照（CK），把生長狀態(tài)一致的愈傷組織分別接種于對照和含有不同濃度NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在培養(yǎng)0、3、6、9、12、15d時測定各生理指標。

1.2測定項目及方法

采用蒽酮法測定[11]可溶性糖含量；采用考馬斯亮藍G-250染色法[11]測定可溶性蛋白含量；采用磺基水楊酸提取法[11]測定游離脯氨酸含量；采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法[11]測定MDA含量；采用愈創(chuàng)木酚法[11]測定POD活性；采用氮藍四唑（NBT）光化還原法[11]測定SOD活性。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度鹽脅迫對流蘇樹愈傷組織形態(tài)的影響

由表1、圖1可知，50mmol/LNaCl濃度對愈傷組織的生長影響很小，培養(yǎng)前9d，愈傷組織生長稍慢于對照，12d后，愈傷組織生長狀態(tài)與對照相同；100～200mmol/LNaCl的處理會阻礙愈傷組織的生長，鹽濃度越高和培養(yǎng)時間越長，愈傷組織的生長狀態(tài)越差，培養(yǎng)15d時，100mmol/LNaCl處理的愈傷組織生長緩慢，有部分發(fā)生褐化；150mmol/LNaCl處理的愈傷組織生長大部分發(fā)生褐化；200mmol/LNaCl會造成愈傷組織的嚴重褐化、死亡。

2.2不同濃度鹽脅迫對流蘇樹愈傷組織滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

2.2.1不同濃度鹽脅迫對流蘇樹愈傷組織可溶性糖含量的影響

從圖2可以看出，隨脅迫時間的延長，愈傷組織中可溶性糖含量整體呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。對照愈傷組織可溶性糖含量在脅迫后6d最低，為5.59mg/g；之后開始上升，脅迫后15d最高，為38.47mg/g。200mmol/LNaCl處理的可溶性糖在脅迫后3d最低，為6.70mg/g，僅為對照的57.01%；之后開始上升，到脅迫后15d最高，比對照高45.85%。50mmol/LNaCl處理在前6d均高于對照，脅迫后6d比對照高89.42%；脅迫后9～15d一直低于對照，脅迫后15d為對照的79.59%。2.2.2不同濃度鹽脅迫對流蘇樹愈傷組織游離脯氨酸含量的影響

圖3顯示，脅迫后3、6、9d，CK愈傷組織的游離脯氨酸含量顯著高于接種當天，脅迫后12～15d游離脯氨酸顯著低于接種當天；50mmol/LNaCl處理的游離脯氨酸含量在培養(yǎng)期間均低于對照，脅迫后15d僅為對照的71.82%；在脅迫前期，100～200mmol/LNaCl處理組脯氨酸含量均低于對照，在脅迫后期高于對照，并且隨著NaCl濃度的提高，高于對照的時間提前（100、150、200mmol/LNaCl處理分別在脅迫后15、12、9d時高于對照），脅迫后15d，100、150、200mmol/LNaCl處理的游離脯氨酸含量分別比對照高62.56%、139.17%、177.22%。

2.2.3不同濃度鹽脅迫對流蘇樹愈傷組織可溶性蛋白含量的影響

從圖4可以看出，整個試驗過程中，所有處理可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。對照在脅迫后3d達到最高，比接種當天高18.89%；之后開始下降，到脅迫后15d達到最低，為接種當天的78.61%。50mmol/LNaCl處理的可溶性蛋白含量在脅迫前9d持續(xù)升高，在脅迫后9d達到最大，比對照高16.03%；之后開始下降，脅迫后15d比對照高9.85%。100～200mmol/LNaCl處理可溶性蛋白含量均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，且脅迫前6d均高于對照，150、200mmol/LNaCl處理在脅迫后9d低于對照，100mmol/LNaCl處理在脅迫后12d低于對照，脅迫后15d分別為對照的91.19%、66.22%、56.09%。

2.3不同濃度鹽脅迫對流蘇樹愈傷組織MDA含量的影響

圖5顯示，脅迫后3d，CK的MDA含量稍微有所上升，比接種當天高5.18%，之后開始下降，脅迫后15d降到最低，僅為接種當天的66.38%；50～200mmol/LNaCl處理的MDA含量均在脅迫后3d升至最高，分別比對照高30.45%、103.49%、158.11%、194.32%，之后開始下降，脅迫后15d降到最低，但依然高于對照，分別比對照高13.68%、50.66%、228.13%、276.89%。

2.4不同濃度鹽脅迫對流蘇樹愈傷組織保護酶活性的影響

2.4.1不同濃度鹽脅迫對流蘇樹愈傷組織SOD活性的影響

從圖6可以看出，對照組愈傷組織中SOD活性在脅迫前9d持續(xù)上升，脅迫后9d達到最高，比接種當天高128.48%，之后稍有下降，脅迫后15d比對照高78.80%；50mmol/LNaCl處理組脅迫后6d升至最高，比對照高76.81%，之后開始下降，脅迫后15d比對照高26.56%；100～200mmol/LNaCl處理組均在脅迫后3d升到最高，分別比對照高191.07%、243.68%、259.39%，脅迫后6、9、12d持續(xù)下降，脅迫后15d稍有上升，這3個鹽脅迫處理分別比對照高175.84%、185.42%、205.32%。

2.4.2不同濃度鹽脅迫對流蘇樹愈傷組織POD活性的影響

圖7顯示，對照組愈傷組織中POD活性在脅迫前6d有所下降，脅迫后6d降到最低，僅為對照的85.11%，之后開始上升，脅迫后15d比接種當天高21.28%。50、100、150、200mmol/LNaCl處理在脅迫后3d均降到最低，分別為對照的7.75%、9.30%、19.38%、27.13%；之后開始上升，脅迫后6d比對照高；脅迫后15d均升到最高，比對照高158.95%、209.12%、215.79%、265.50%。

3結(jié)論與討論

3.1鹽脅迫對流蘇樹愈傷組織滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

可溶性糖和脯氨酸都是植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與滲透脅迫下細胞水勢的調(diào)節(jié)[13-15]，可溶性糖主要包括葡萄糖、海藻糖、蔗糖等。這些可溶性糖類參與滲透調(diào)節(jié)，并可能在維持植物蛋白質(zhì)穩(wěn)定方面起重要作用[16]。關于脯氨酸在抗鹽脅迫中作用的研究近年來有許多報道，一般認為脯氨酸在植物體內(nèi)是一種重要的滲透調(diào)節(jié)劑，在鹽脅迫下脯氨酸在植物細胞中大量積累，這對降低細胞的水勢有一定的作用；脯氨酸可以保護細胞中的生物大分子的結(jié)構(gòu)，使之不被NaCl破壞，并能維持其完整的水合范圍；脯氨酸的高度溶解性以及其對各種酶活性的不抑制性可以擴大細胞的溶解溶積，從而降低細胞質(zhì)液中鹽的濃度，減輕鹽的脅迫程度[17]。

在植物細胞中的可溶性蛋白有相當一部分是具有特異性作用的調(diào)節(jié)代謝的酶，還有一些可能起脫水保護劑的作用，給細胞內(nèi)的束縛水提供一個結(jié)合襯質(zhì)以增加束縛水含量，從而使細胞結(jié)構(gòu)在脫水時不致遭受更大的破壞[18]。

圖2、圖3顯示，在鹽脅迫初期，流蘇樹愈傷組織體內(nèi)可溶性糖和游離脯氨酸含量都與本試驗開始時持平甚至有所下降，而可溶性蛋白含量明顯上升，表明在一定程度的滲透脅迫下，細胞內(nèi)可合成新的蛋白[7]，且這些蛋白在抗逆性上起主要作用。到鹽脅迫中后期，可溶性蛋白和游離脯氨酸開始大量合成積累，其中可溶性糖含量最先上升，其次是游離脯氨酸含量。這說明在鹽脅迫下可溶性糖在滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮了積極的作用[19]，降低了細胞的滲透勢，從而抵御了逆境。游離脯氨酸含量的增加和脅迫時間有關，說明游離脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在后期開始大量合成，補充可溶性糖的作用，協(xié)同抵御逆境。早在1964年Strogonov就提出，NaCl可以影響蛋白質(zhì)合成過程[7]，本試驗中可溶性蛋白含量在鹽脅迫中后期下降，可能就是NaCl影響的結(jié)果。

3.2鹽脅迫對流蘇樹愈傷組織MDA的影響

圖5顯示，重度脅迫（100～200mmol/LNaCl）的處理組MDA含量在鹽脅迫初期就開始大量增加，輕度脅迫（50mmol/LNaCl）處理組的變化較小，相應的SOD活性（圖6）在脅迫初期也在下降，說明在脅迫初期，逆境對流蘇樹愈傷組織的生長有一定影響，由此可初步推測流蘇樹愈傷組織對于鹽脅迫的不良環(huán)境需要一定的適應時間，在脅迫初期還沒有有效抵御逆境的變化，這與可溶性糖含量變化的推測結(jié)果符合，在未作出反應應答前，鹽脅迫對膜系統(tǒng)的傷害較大，導致丙二醛大量積累。到鹽脅迫中后期，由于SOD和POD活性已經(jīng)增強（圖6、圖7），有效清除了代謝過程中產(chǎn)生的活性氧，從而防止了活性氧引起的膜脂過氧化作用，減少了MDA的產(chǎn)生[3]。

3.3鹽脅迫對流蘇樹愈傷組織保護酶活性的影響

SOD是植物處于逆境中最主要的一種抗氧化酶，它能及時清除自由基和活性氧，提高植物組織的抗氧化能力[10，20-21]。圖6顯示，在脅迫初期，所有處理的SOD活性均有所升高，其中50mmol/LNaCl處理的SOD活性變化趨勢與對照相似，均呈現(xiàn)先增強后減弱再趨于穩(wěn)定，這與姚琳的基于電阻抗圖譜法檢測流蘇抗鹽性研究的結(jié)果[10]相似。到鹽脅迫中后期，其他處理的SOD活性變化趨勢基本是先增強后稍減弱，然后基本恢復至最高水平，說明中鹽和高鹽條件可誘導SOD活性增強，這與楊帆等對SOD活性的研究結(jié)果[22]一致。

POD的主要作用是消除由SOD作用產(chǎn)生的過量H2O2，使H2O2維持在一個較低的水平[10]。POD通過催化其他底物與H2O2反應以消耗H2O2[23-24]。在本試驗中，各脅迫處理的POD活性在脅迫初期均有所減弱，說明在鹽脅迫初期起主要保護作用的酶不是POD。到了脅迫中后期，POD活性的整體上持續(xù)增強，說明隨著鹽脅迫時間的延長，SOD作用產(chǎn)生的H2O2越來越多，急需POD來清除過多的H2O2，從而與SOD協(xié)同作用，共同抵御活性氧對膜系統(tǒng)的傷害。

另外，可能由于SOD和POD活性對鹽脅迫的應答機理不同，導致它們各自的活性變化并不完全一致，并且流蘇體內(nèi)能夠分解H2O2的酶還有CAT（過氧化氫酶），該酶是否起到了重要作用，還需通過試驗進一步確定。

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3.2鹽脅迫對流蘇樹愈傷組織MDA的影響

圖5顯示，重度脅迫（100～200mmol/LNaCl）的處理組MDA含量在鹽脅迫初期就開始大量增加，輕度脅迫（50mmol/LNaCl）處理組的變化較小，相應的SOD活性（圖6）在脅迫初期也在下降，說明在脅迫初期，逆境對流蘇樹愈傷組織的生長有一定影響，由此可初步推測流蘇樹愈傷組織對于鹽脅迫的不良環(huán)境需要一定的適應時間，在脅迫初期還沒有有效抵御逆境的變化，這與可溶性糖含量變化的推測結(jié)果符合，在未作出反應應答前，鹽脅迫對膜系統(tǒng)的傷害較大，導致丙二醛大量積累。到鹽脅迫中后期，由于SOD和POD活性已經(jīng)增強（圖6、圖7），有效清除了代謝過程中產(chǎn)生的活性氧，從而防止了活性氧引起的膜脂過氧化作用，減少了MDA的產(chǎn)生[3]。

3.3鹽脅迫對流蘇樹愈傷組織保護酶活性的影響

SOD是植物處于逆境中最主要的一種抗氧化酶，它能及時清除自由基和活性氧，提高植物組織的抗氧化能力[10，20-21]。圖6顯示，在脅迫初期，所有處理的SOD活性均有所升高，其中50mmol/LNaCl處理的SOD活性變化趨勢與對照相似，均呈現(xiàn)先增強后減弱再趨于穩(wěn)定，這與姚琳的基于電阻抗圖譜法檢測流蘇抗鹽性研究的結(jié)果[10]相似。到鹽脅迫中后期，其他處理的SOD活性變化趨勢基本是先增強后稍減弱，然后基本恢復至最高水平，說明中鹽和高鹽條件可誘導SOD活性增強，這與楊帆等對SOD活性的研究結(jié)果[22]一致。

POD的主要作用是消除由SOD作用產(chǎn)生的過量H2O2，使H2O2維持在一個較低的水平[10]。POD通過催化其他底物與H2O2反應以消耗H2O2[23-24]。在本試驗中，各脅迫處理的POD活性在脅迫初期均有所減弱，說明在鹽脅迫初期起主要保護作用的酶不是POD。到了脅迫中后期，POD活性的整體上持續(xù)增強，說明隨著鹽脅迫時間的延長，SOD作用產(chǎn)生的H2O2越來越多，急需POD來清除過多的H2O2，從而與SOD協(xié)同作用，共同抵御活性氧對膜系統(tǒng)的傷害。

另外，可能由于SOD和POD活性對鹽脅迫的應答機理不同，導致它們各自的活性變化并不完全一致，并且流蘇體內(nèi)能夠分解H2O2的酶還有CAT（過氧化氫酶），該酶是否起到了重要作用，還需通過試驗進一步確定。

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3.2鹽脅迫對流蘇樹愈傷組織MDA的影響

圖5顯示，重度脅迫（100～200mmol/LNaCl）的處理組MDA含量在鹽脅迫初期就開始大量增加，輕度脅迫（50mmol/LNaCl）處理組的變化較小，相應的SOD活性（圖6）在脅迫初期也在下降，說明在脅迫初期，逆境對流蘇樹愈傷組織的生長有一定影響，由此可初步推測流蘇樹愈傷組織對于鹽脅迫的不良環(huán)境需要一定的適應時間，在脅迫初期還沒有有效抵御逆境的變化，這與可溶性糖含量變化的推測結(jié)果符合，在未作出反應應答前，鹽脅迫對膜系統(tǒng)的傷害較大，導致丙二醛大量積累。到鹽脅迫中后期，由于SOD和POD活性已經(jīng)增強（圖6、圖7），有效清除了代謝過程中產(chǎn)生的活性氧，從而防止了活性氧引起的膜脂過氧化作用，減少了MDA的產(chǎn)生[3]。

3.3鹽脅迫對流蘇樹愈傷組織保護酶活性的影響

SOD是植物處于逆境中最主要的一種抗氧化酶，它能及時清除自由基和活性氧，提高植物組織的抗氧化能力[10，20-21]。圖6顯示，在脅迫初期，所有處理的SOD活性均有所升高，其中50mmol/LNaCl處理的SOD活性變化趨勢與對照相似，均呈現(xiàn)先增強后減弱再趨于穩(wěn)定，這與姚琳的基于電阻抗圖譜法檢測流蘇抗鹽性研究的結(jié)果[10]相似。到鹽脅迫中后期，其他處理的SOD活性變化趨勢基本是先增強后稍減弱，然后基本恢復至最高水平，說明中鹽和高鹽條件可誘導SOD活性增強，這與楊帆等對SOD活性的研究結(jié)果[22]一致。

POD的主要作用是消除由SOD作用產(chǎn)生的過量H2O2，使H2O2維持在一個較低的水平[10]。POD通過催化其他底物與H2O2反應以消耗H2O2[23-24]。在本試驗中，各脅迫處理的POD活性在脅迫初期均有所減弱，說明在鹽脅迫初期起主要保護作用的酶不是POD。到了脅迫中后期，POD活性的整體上持續(xù)增強，說明隨著鹽脅迫時間的延長，SOD作用產(chǎn)生的H2O2越來越多，急需POD來清除過多的H2O2，從而與SOD協(xié)同作用，共同抵御活性氧對膜系統(tǒng)的傷害。

另外，可能由于SOD和POD活性對鹽脅迫的應答機理不同，導致它們各自的活性變化并不完全一致，并且流蘇體內(nèi)能夠分解H2O2的酶還有CAT（過氧化氫酶），該酶是否起到了重要作用，還需通過試驗進一步確定。

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