劉 曉 ，林承喜, ，張平平，楊笑熳，趙 勇 ，李春鳳, ，孫崇云, ，邱景富，楊瑞馥，周 蕾

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，重慶400016；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京100071；3. 中海智（北京）科技有限公司，北京100027；4. 中國人民解放軍總醫(yī)院，北京100853）

《禁毒法》第二條規(guī)定：“本法所稱毒品，是指鴉片、海洛因、甲基苯丙胺（冰毒）、嗎啡、大麻、可卡因以及國家規(guī)定管制的其他能夠使人形成癮癖的麻醉藥品和精神藥品”。在國家食品藥品監(jiān)督管理總局2012 年發(fā)布的《國家藥物濫用監(jiān)測年度報告》中指出：海洛因與“冰毒”是主要濫用物質(zhì)，“冰毒”濫用者有增長趨勢。嗎啡（Morphine，MOP）是鴉片重要成分，也是海洛因在尿液中的代謝物質(zhì)。甲基苯丙胺（Methamphetamine，MET）因其外觀似冰故俗稱為“冰毒”，是一種具有強(qiáng)烈興奮中樞神經(jīng)作用的苯丙胺類物質(zhì)，MET 攝入體內(nèi)后，大部分以原形從尿中排出[1]。

毒品檢測對吸毒行為的認(rèn)定、戒毒治療過程的監(jiān)控具有重要作用，是檢察起訴、法院量刑的重要依據(jù)，對打擊毒品犯罪、開展禁毒戒毒工作具有重要意義[2-3]。目前，毒品的檢測主要包括確證與初篩兩種類型。確證方法主要包括色譜法、光譜法、質(zhì)譜法等[4-12]，可實現(xiàn)定量檢測，且結(jié)果可靠，但需嚴(yán)格的質(zhì)控規(guī)程、標(biāo)準(zhǔn)的樣品處理及精密的儀器分析，其方法復(fù)雜對于操作人員與操作環(huán)境依賴性過強(qiáng)。為滿足現(xiàn)場大量樣品的快速篩查，近年來各種初篩技術(shù)不斷涌現(xiàn)，其中最為成熟的技術(shù)是膠體金免疫層析[13]、酶聯(lián)免疫[14]等，可實現(xiàn)快速定性或半定量檢測，但現(xiàn)場初篩操作下的全定量檢測尚未實現(xiàn)。針對這一問題，本研究以免疫層析技術(shù)為基礎(chǔ)，將新型上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料（Up-converting Phosphor Nano-Particles, UCP-NPs）[15-16]作為生物示蹤物與其有機(jī)結(jié)合，采用競爭免疫模式，研制可對尿液MOP及MET 進(jìn)行精確定量檢測的兩種上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析（Up-converting Phosphor Technology based Lateral Flow, UPT-LF）試紙。本研究所建立的方法同時兼顧了現(xiàn)場條件下“操作的簡便、快捷”以及“結(jié)果的精確定量”，從而為警方對涉嫌吸毒人員進(jìn)行現(xiàn)場快速篩查提供了可靠便捷的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

UCP-NPs（NaYF4: Yb3+，Er3+，粒徑50nm，激發(fā)光980nm，發(fā)射光541.5nm）由上海科研光電科技有限公司制備。硝酸纖維素膜（SHF1350225）、玻璃纖維（GFCP20300）、吸水紙及粘性底襯購自美國Millipore 公司；試紙條塑料外殼由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所分析微生物實驗室設(shè)計，深圳金燦華公司制造。小牛血清白蛋白（BSA）、蔗糖、聚乙烯醇（PVA）及十二烷基磺酸鈉（SDS）等生化試劑購自美國Sigma-Aldrich；MOP、MET 標(biāo)準(zhǔn)品購自公安部物證鑒定中心；MOP、MET 單克隆抗體及其與BSA 交聯(lián)抗原購自杭州隆基生物技術(shù)有限公司。膠體金試劑盒購自艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司。尿液樣品為現(xiàn)場執(zhí)法時采集，嗎啡陽性尿液樣品經(jīng)LC-MS 確證，冰毒陽性尿液樣本經(jīng)GC-MS 確證。

UPT 生物傳感器（上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫分析儀，UPT-3A 型）由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所與中國科學(xué)院上海光學(xué)精密機(jī)械研究所聯(lián)合研制。其它主要設(shè)備包括：5417R 高速離心機(jī)（Eppendorf），噴膜機(jī)（Imagene Echnology），DHG-9245A 烘干機(jī)（上海一恒科學(xué)儀器），ZQ4000 數(shù)控高速斬切機(jī)（上海金標(biāo)生物科技有限公司）。

1.2 UPT-LF 試紙條研制

對MOP 進(jìn)行痕量檢測（1ng/mL）的MOP 定量檢測UPT-LF 試紙（MOP-UPT-LF）的制備方法如下。樣品墊制備：吸水紙于樣品墊處理液（0.3mol/L pH7.2 磷酸鹽緩沖液含0.5%SDS、1%BSA、0.5%PVA）中浸泡10min，取出后37℃烘干2h，備用；結(jié)合墊制備：將UCP-NPs 與抗MOP 單克隆抗體、羊IgG 分別共價偶聯(lián)[17]，用結(jié)合物稀釋液（0.03mol/L pH7.2 磷酸鹽緩沖液含0.01%SDS、0.5%PEG20000、1%BSA）將UCP-抗MOP 單克隆抗體結(jié)合物與UCP-羊IgG結(jié)合物等比混合，以終濃度0.2mg/mL 泡玻璃纖維5min，45℃下烘干50min，備用；分析膜制備：將終濃度0.5 mg/mL MOP-BSA 與1mg/mL 兔抗羊IgG，按2μL/cm 噴點于分析膜上作為檢測帶（T）與質(zhì)控帶（C），45℃下15min 烘干，備用。將樣品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水墊依次貼于底襯上，4mm/條斬切后放入塑料外殼，備用。

對MOP、MET 進(jìn)行常規(guī)閾值濃度（MOP：300ng/mL；MET：1000 ng/mL） 檢 測 的MOP 定量 檢 測UPT-LF 試 紙（MOP-UPT-LF） 與MET 定量檢測UPT-LF 試紙（MET-UPT-LF）制備方法如下。樣品墊制備：MET-UPT-LF 樣品墊處理液為0.3mol/L pH7.2 磷酸鹽緩沖液含0.5%SDS、1%BSA、0.5%PEG8000、0.1%NaCl，其余同上；結(jié)合墊制備：UCP-抗MOP/MET 單克隆抗體結(jié)合物與UCP-羊IgG 結(jié)合物等比混合，以終濃度0.5mg/mL 浸泡玻璃纖維，其余同上；分析膜制備：將終濃度1.5mg/mL MOP-BSA/MET-BSA 與2mg/mL 兔抗羊IgG 噴點于分析膜上，其余同上。

100μL 尿液樣品直接添加于試紙條樣品墊部分，靜置層析15min。用UPT 生物傳感器對分析膜進(jìn)行掃描分析，獲得檢測帶對應(yīng)的T 值與質(zhì)控帶對應(yīng)的C 值，以T/C 作為檢測結(jié)果。檢測的過程中待檢MOP/MET 與T 帶上的MOP-BSA/MET-BSA 競爭結(jié)合UCP-抗MOP/MET 抗體復(fù)合物，從而形成樣品中MOP 或MET 濃度與T/C 值呈反比的量效關(guān)系，若待檢樣品T/C 值小于Cutoff 值（空白均值-3×標(biāo)準(zhǔn)差），則樣品判定為陽性，反之為陰性。

1.3 敏感性、線性及精密性評價

1.4 定性檢測現(xiàn)場評價

現(xiàn)場采集涉嫌吸毒人員尿液，包括97 份嗎啡現(xiàn)場篩查尿樣及30 份冰毒現(xiàn)場篩查尿樣，嗎啡篩查尿液樣品經(jīng)LC-MS 確證，其中41 份為嗎啡陽性，56份為嗎啡陰性；冰毒篩查尿液樣本經(jīng)GC-MS 確證，其中22 份為冰毒陽性，8 份為冰毒陰性。將上述尿液，100μL/條直接儀器上樣，分別進(jìn)行MOP-UPT-LF 及MET-UPT-LF 檢測，同時按試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行膠體金試紙條檢測，膠體金檢測MOP 陽性閾值為300ng/mL、MET 陽性閾值為1000ng/mL。分別以LC-MS及GC-MS 檢測結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，比較UPT-LF 與膠體金兩種方法定性檢測一致性，評價MOP-UPT-LF及MET-UPT-LF 對現(xiàn)場尿樣的定性檢測能力。

1.5 定量檢測現(xiàn)場評價

以陰性尿樣分別加入MOP 及MET 標(biāo)準(zhǔn)品，配制系列濃度模擬陽性樣品，MOP 模擬樣品系列濃度為50ng/mL，150ng/mL，300ng/mL，450ng/mL，1000ng/mL，3000ng/mL；MET 模擬樣品系列濃度為125ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL，1500ng/mL，3000ng/mL。對MOP 模擬陽性樣本同時進(jìn)行LC-MS 及UPTLF 定量檢測，MET 模擬陽性樣本同時進(jìn)行GC-MS及UPT-LF 定量檢測，分別比較兩種檢測方法定量結(jié)果一致性，評價MOP-UPT-LF/MET-UPT-LF 對尿液中MOP/MET 定量檢測性能。

2 結(jié) 果

2.1 敏感性、線性及精密性評價

隨著MOP、MET 濃度增加，T/C 值降低，以Logit（T/C）作為橫坐標(biāo)（x），Log（濃度[ng/mL]）作為縱坐標(biāo)（y），獲得標(biāo)準(zhǔn)定量曲線（見圖1），經(jīng)統(tǒng)計擬合分析可知在痕量檢測條件下，MOP-UPTLF 對MOP 進(jìn)行檢測在1～5000ng/mL 之間具有線性關(guān)系（r = -0.98172，P ＜ 0.0005）（見圖1D）；按常規(guī)檢測需求調(diào)整后，MOP-UPT-LF 對MOP 進(jìn)行檢測在50～3000ng/mL 之間具有線性關(guān)系（r = -0.98464， P ＜0.0005）（見圖1E），MET-UPT-LF 對MET 進(jìn)行檢測在100～5000ng/mL 之間具有線性關(guān)系（r = -0.99964，P ＜ 0.0005）（見圖1F）。

2.2 定性檢測現(xiàn)場評價

如表1 所示，對于尿液中MOP 及MET 的定性檢測，MOP-UPT-LF 及MET-UPT-LF 與膠體金結(jié)果一致，均無假陽性及假陰性結(jié)果出現(xiàn)，檢測效能較優(yōu)。如圖2 所示，MOP-UPT-LF（見圖2A）檢測尿液中MOP，ROC 曲線下面積為1.000±0.000（95%CI），MET-UPT-LF（見圖2B）檢測尿液中MET，ROC 曲線下面積為1.000±0.000（95%CI），診斷準(zhǔn)確性均較優(yōu)。

2.3 定量檢測現(xiàn)場評價

采用LC-MS/GC-MS 與MOP-UPT-LF/MET-UPTLF 對模擬陽性樣品進(jìn)行定量檢測，分別根據(jù)其定量曲線計算樣品中MOP 及MET 回歸濃度，結(jié)果見表2。就尿液中MOP 檢測而言，MOP-UPT-LF 檢測回收率在77%～133%之間，均值與CV 分別為109%、21%，LC-MS 檢測回收率在80%～131%之間，均值與CV 分別為112%、17%；就尿液中MET 檢測而言，MET-UPT-LF 檢測回收率在81%～119%之間，均值與CV 分別為105%、12%，GC-MS 檢測回收率在56%～101%之間，均值與CV 分別為85%、19%。將MOP-UPT-LF 與LC-MS 的回收率進(jìn)行配對t 檢驗，t= 0.591，P ＞ 0.05；將MET-UPT-LF 與GC-MS 的回收率進(jìn)行配對t 檢驗，t = 2.271，P ＞ 0.05；即就定量檢測結(jié)果而言MOP-UPT-LF 及MET-UPT-LF 與傳統(tǒng)確證方法LC-MS 及GC-MS 無顯著性差異，且就平均回收率而言，MOP-UPT-LF（109%）及MET-UPTLF（105%）略優(yōu)于定量確證方法LC-MS（112%）及GC-MS（84%），其檢測性能可滿足現(xiàn)場快速定量檢測要求。

圖1 MOP-UPT-LF/MET-UPT-LF 濃度響應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)定量曲線。A：MOP 痕量檢測；B：MOP 常規(guī)檢測；C：MET 常規(guī)檢測；D：MOP 痕量檢測；E：MOP 常規(guī)檢測；F：MET 常規(guī)檢測。Fig.1 Concentration-response relationship and standard quantitative curve of MOP-UPT-LF/MET-UPT-LF. A: trace detection of MOP; B: routine threshold detection of MOP; C: routine threshold detection of MET; D: trace detection of MOP; E: routine threshold detection of MOP; F: routine threshold detection of MET. The detection limit of MOP-UPT-LF reached 1ng/mL with a linear range from 1ng/mL to 5000ng/mL (r = -0.98172, P ＜ 0.0005) in trace detection. In detection with the routine threshold, the detection limit of MOP-UPT-LF was 50ng/mL with a linear range from 50ng/mL to 3000ng/mL (r = -0.98464, P ＜ 0.0005). The detection limit of METUPT-LF was 100ng/mL with a linear range from 100ng/mL to 5000ng/mL (r = -0.99964, P ＜ 0.0005).

表1 現(xiàn)場尿樣MOP-UPT-LF 及MET-UPT-LF 定性檢測評價Table 1 Qualitative detection of MOP-UPT-LF and MET-UPT-LF in on-site urine samples

圖2 MOP-UPT-LF MET-UPT-LF ROC 曲線。A：41 份MOP 陽性，56 份MOP 陰性尿液MOP-UPT-LF 檢測結(jié)果；B：22份MET 陽性，8 份MET 陰性尿液MET-UPT-LF 檢測結(jié)果。Fig.2 ROC curve of MOP-UPT-LF and MET-UPT-LF. A: 41 positive and 56 negative MOP urine samples tested with MOP-UPTLF; B: 22 positive and 8 negative MET urine samples obtained with MET-UPT-LF. Both detections owned a high diagnostic value with a ROC area of 1.000±0.000 (95%CI).

表2 尿液中MOP-UPT-LF/MET-UPT-LF 檢測回收率Table 2 Recovery rate of MOP-UPT-LF and MET-UPT-LF in urine sample

3 討 論

近年來伴隨體外診斷技術(shù)的迅猛發(fā)展，縮短現(xiàn)場初篩技術(shù)與實驗室確證技術(shù)之間的性能差異，提高現(xiàn)場執(zhí)法準(zhǔn)確性是大勢所趨。膠體金免疫層析技術(shù)由于操作簡便、價格低廉、無需輔助設(shè)備而廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場篩查，但其存在肉眼判讀主觀差異及檢測結(jié)果無法有效保存的問題。本研究在承襲層析技術(shù)簡便快捷的基礎(chǔ)上，采用具有獨特上轉(zhuǎn)換發(fā)光現(xiàn)象的UCPNPs 作為光學(xué)生物示蹤物，使免疫層析與生物智能傳感有機(jī)融合，實現(xiàn)了現(xiàn)場初篩條件下的自動儀器判讀與精確定量，使現(xiàn)場執(zhí)法結(jié)果作為證據(jù)永久保存得以實現(xiàn)。經(jīng)系統(tǒng)評價在痕量MOP 檢測中，MOP-UPTLF 敏感性可達(dá)1ng/mL，在1～5000ng/mL 之間具有線性關(guān)系（r = -0.98172，P ＜ 0.0005）；在常規(guī)檢測中，MOP-UPT-LF 敏感性為50ng/mL，在50～3000ng/mL之間可精確定量（r = -0.98464，P ＜ 0.0005），METUPT-LF 敏感性為100ng/mL，在10～5000ng/mL 之間可精確定量（r = -0.99964，P ＜ 0.0005）。在定性檢測評價中，MOP-UPT-LF 及MET-UPT-LF 靈敏度均為100%，特異度均為100%，ROC 曲線下面積均為1.000±0.000（95%CI），均具有較優(yōu)檢測效能。其定性檢測能力與目前成熟快篩試劑膠體金一致，且MOP-UPT-LF 及MET-UPT-LF 具有其他快篩試劑所不具備的定量檢測能力，與確證方法LC-MS 及GC-MS 定量能力比較無顯著差異。MOP-UPT-LF 與MET-UPT-LF 操作簡便，樣品無需前處理即可直接上樣，16min 內(nèi)可出檢測結(jié)果，具備快速、敏感性高、特異性好、可精確定量等諸多優(yōu)點，為打擊毒品犯罪，開展禁毒、戒毒工作提供了先進(jìn)的毒品檢測技術(shù)。

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