張 婷 ，楊瑞琴

（1.中國(guó)人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100038；2.中國(guó)刑事警察學(xué)院法化學(xué)系，沈陽(yáng) 110854）

免疫分析技術(shù)是以抗原-抗體的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的微量、快速、靈敏的分析技術(shù)，該技術(shù)在生命科學(xué)、藥物分析、食品安全、公安工作等多種領(lǐng)域均有著廣泛的應(yīng)用[1]。免疫分析技術(shù)是醫(yī)學(xué)、藥學(xué)分析的基礎(chǔ)，其應(yīng)用有著悠久歷史，該技術(shù)在食品安全中對(duì)農(nóng)產(chǎn)品及家畜產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留以及非法添加物的快速篩選檢測(cè)應(yīng)用實(shí)例較多，而免疫分析技術(shù)在公安工作中的應(yīng)用最多的是對(duì)涉嫌吸食毒品人員的尿液、唾液、血液等樣品的毒品進(jìn)行快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)來使用，通過免疫試紙條的快速檢測(cè)可初步判定是否吸食毒品以及吸食毒品的種類。免疫分析技術(shù)在指紋學(xué)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用直到2007 年才首次有報(bào)道。

免疫分析技術(shù)與指紋的研究對(duì)接，主要是通過指紋上汗腺所分泌的有機(jī)化學(xué)成分，以及指紋在接觸有機(jī)藥物的過程中遺留在指紋皺褶處的藥物殘留成分，這些指紋中殘留或分泌的物質(zhì)可以通過免疫動(dòng)物來獲得特異性一抗，再通過免疫及熒光標(biāo)記等方式獲得標(biāo)記的二抗，最后以抗原和抗體的特異性，來獲得可供觀察的熒光特征圖像。免疫技術(shù)在指紋分析中面臨的最大困難是指紋中有機(jī)化學(xué)成分含量甚微，有機(jī)成分不到1%[2]，其中可用于免疫分析的蛋白質(zhì)成分含量更少，因此在指紋中化學(xué)成分的免疫分析技術(shù)完全不同于以往的免疫技術(shù)，免疫試劑的應(yīng)用既要保證分析測(cè)試儀器的要求，又要保證盡量地不破壞指紋作為證據(jù)時(shí)原有形態(tài)特征。所以在已報(bào)道的指紋中化學(xué)成分免疫分析方法中，主要以指紋中毒品成分、違禁藥物成分、氨基酸成分的免疫分析技術(shù)為主。

1 免疫納米金材料分析指紋中單種毒品

Leggett 及其團(tuán)隊(duì)[3]在2007 年首次進(jìn)行用可替寧（尼古丁的主要代謝產(chǎn)物）抗體功能化的金納米材料進(jìn)行指紋顯現(xiàn)研究，主要用于同時(shí)檢測(cè)吸煙者指紋中的可替寧成分和吸煙者的指紋圖像。這種方法在實(shí)現(xiàn)個(gè)體識(shí)別的基礎(chǔ)上，還可以對(duì)被檢客體指紋中是否含有某一種毒品或其代謝產(chǎn)物進(jìn)行判斷?？贵w與納米金的結(jié)合使用了3-(2-吡啶二巰基)丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（SPDP）這種異型雙功能交聯(lián)劑。結(jié)合原理見圖1、圖2。

在這個(gè)研究中，功能蛋白A 可以自結(jié)合于金納米材料?？箍商鎸幙贵w通過蛋白A 與納米材料功能性結(jié)合，這種抗體金納米結(jié)合物與載玻片上提取的一枚指紋共同孵育，孵育過程后將多余的一抗洗去，然后又加入一種熒光染料標(biāo)記的二抗片段，用于熒光標(biāo)記指紋。當(dāng)這枚指紋用熒光立體顯微鏡成像時(shí)，對(duì)于吸煙者指紋中的沉積物可以得到高分辨圖像。這種成像清晰充分地顯示了指紋乳突花紋的細(xì)節(jié)特征，可用于個(gè)體識(shí)別。更高倍的放大可以顯示花紋分支處的二級(jí)細(xì)節(jié)特征，像汗孔排列這樣的三級(jí)特征均可清晰所見。

Leggett 等人的研究結(jié)果最重要的意義在于，在不吸煙的志愿者所提供的指紋嵴中是沒有熒光圖像的。這個(gè)結(jié)果表明抗體金納米結(jié)合物是與指紋中出現(xiàn)的可替寧抗原特異性結(jié)合的。在此實(shí)驗(yàn)中如只使用抗可替寧抗體，而不使用金納米材料結(jié)合的話，只能判斷尼古丁代謝物的存在, 但沒有辦法獲得清晰的、高質(zhì)量的指紋圖像，因此研究表明了納米材料的使用在獲得高分辨指紋圖像時(shí)的重要性。該免疫技術(shù)與材料技術(shù)在指紋分析中的初步嘗試，可以用于個(gè)體識(shí)別，還可以用于濫用藥物檢測(cè)和評(píng)價(jià)。隨后的蘇忠民等[4]則是在抗體制備和觀測(cè)方法上做了部分改進(jìn)，其團(tuán)隊(duì)利用巰基苯胺或巰基苯甲胺來修飾15nm 的金納米顆粒，并與可替寧抗體結(jié)合來制備金納米探針，取吸煙者的指紋與可替寧抗體金納米探針進(jìn)行孵育，孵育后去除多余的抗體后，并用銀染技術(shù)顯現(xiàn)指紋，在拉曼光譜儀上通過488nm 或514nm 的拉曼光譜分析，若有此光譜下的特征吸收則證明指紋為吸煙者所留。

圖1 可替寧抗體標(biāo)記納米金示意圖[3]Fig.1 Schematic representation of the cotinine’s antibodynanoparticle conjugates[3]

圖2 金納米材料檢測(cè)潛指紋中毒品及其代謝物的示意圖[3]。A1：納米金與功能蛋白A 結(jié)合；A2：納米金與一抗的結(jié)合物；A3：玻璃上吸煙者的潛指紋與抗體的孵育；A4：熒光標(biāo)記二抗反應(yīng)后所呈現(xiàn)的熒光變化。Fig.2 Schematic representation of the detection of drugs and drug metabolites in latent fingerprints using gold nanoparticles[3]. A1:gold nanoparticles coated with protein A; A2: binding a primary antibody to the A1 complex; A3: incubation of a smoker’s latent fingerprint deposited on a glass microscope slide with the addition of A2 complex; A4: image after secondary antibody fragment tagged with a fluorescent dye was incubated with A3 complex.

2 免疫納米金材料分析指紋中氨基酸

近幾年來，Spindler 等人[5]延伸了抗體金納米材料的使用范圍，進(jìn)一步增強(qiáng)潛指紋的顯現(xiàn)。指紋中包含有水、脂肪酸、鹽和各種氨基酸，其中氨基酸的濃度能達(dá)到0.3～2.5mg/L，因此比較指紋代謝的可替寧等有機(jī)成分，氨基酸的濃度是理想的增強(qiáng)顯現(xiàn)的化學(xué)成分。這個(gè)團(tuán)隊(duì)制備了L-氨基酸的抗體，并結(jié)合金納米顆粒來檢測(cè)非滲透客體表面的潛指紋中汗液的氨基酸，因此利用免疫技術(shù)不僅可以實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)的指紋顯現(xiàn)，而且該技術(shù)在對(duì)干燥和老化指紋的顯現(xiàn)具有特殊能力。實(shí)驗(yàn)中，3 枚遺留在鋁箔上的指紋分別被放置2 周、4 個(gè)月和12 個(gè)月，通過該技術(shù)仍能獲得清晰的指紋圖像。

3 免疫納米磁材料分析指紋中單種毒品成分

磁性粉末用于法庭潛指紋顯現(xiàn)可追溯到1960 年[6]，在實(shí)踐工作中，磁性粉末應(yīng)用磁性刷來顯現(xiàn)不同客體上的潛指紋，不與指紋結(jié)合的磁性粉末可以通過磁性刷輕松地移除。免疫納米磁性材料的研制和開發(fā)也是基于此能輕松移除未結(jié)合材料的特點(diǎn)，進(jìn)而開發(fā)出單種毒品成分的抗體與磁性粉末相結(jié)合的功能性復(fù)合材料。有關(guān)指紋中毒品成分的分析，近年來所報(bào)道免疫納米磁性材料結(jié)合物，充分利用了磁性粉末便于操作的優(yōu)勢(shì)和抗體特異性識(shí)別的特點(diǎn)來發(fā)揮指紋中毒品檢測(cè)的作用。這種結(jié)合物的制造是通過商品化的鐵磁性材料（1μm 直徑）與功能化的蛋白A/G 結(jié)合，結(jié)合后的功能蛋白分子上可以進(jìn)一步結(jié)合一抗、熒光標(biāo)記二抗。工作原理如圖3 所示。

鐵氧化物是種超順磁性材料，在指紋顯現(xiàn)研究中，當(dāng)鐵氧化物表面結(jié)合上一類重組融合蛋白A 和蛋白G時(shí)，這種結(jié)合重組蛋白的鐵磁性材料有更多的抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以與更多的鼠IgG 抗體亞類結(jié)合，因此這種免疫磁性納米材料可以應(yīng)用在更多種類的藥物及其代謝物成分的檢測(cè)中。這個(gè)方法分析過程包括最初的抗體與結(jié)合功能蛋白A/G 的磁性材料的結(jié)合產(chǎn)生抗體-磁性顆粒結(jié)合物。這種結(jié)合物在一枚指紋上孵育，然后加入熒光標(biāo)記的二抗，熒光標(biāo)記的磁性顆粒鏈接物（見圖3 B1）。指紋用熒光立體顯微鏡觀察。毒品及其毒品代謝物的成功檢測(cè)是通過指紋的顏色改變來證明的，指紋從灰色（見圖3 B3）到黃棕色（見圖3 B4）。熒光標(biāo)記的二抗直接放置在熒光燈下會(huì)發(fā)光產(chǎn)生熒光圖像。P. Hazarika 等人[7-9]成功地制備了不同毒品成分的免疫納米磁性材料，并分別檢測(cè)了載玻片上捺印潛指紋中的四氫大麻酚（THC）、美沙酮、2-乙基-1，5-二甲基-3，3-二苯基哌啶（EDDP，美沙酮的主要代謝物）、苯甲酰愛崗寧（可卡因的主要代謝物）和可替寧（尼古丁的主要代謝物）。免疫納米磁性材料提供了高質(zhì)量的指紋圖像。在案件中非吸毒人員的指紋，在與免疫納米磁性材料孵育反應(yīng)后，在白光照射下不發(fā)生顏色的變化（仍舊是原始的灰色），此外，在這樣的指紋中即使加入熒光二抗，仍舊不顯現(xiàn)指紋熒光圖像，可作為陰性結(jié)果判定。

4 免疫磁性材料分析指紋中的混合毒品成分

圖3 磁納米材料檢測(cè)潛指紋中毒品及其代謝物的示意圖[7]。B1：磁性材料與功能蛋白A/G 的自結(jié)合；B2：磁性材料與一抗的結(jié)合；B3：玻璃上吸毒者的潛指紋與抗體的孵育；B4：白光照射下吸毒者的指紋發(fā)生顏色的改變，從無色變?yōu)樽攸S色；B5：染料標(biāo)記的熒光二抗加入后所呈現(xiàn)的熒光變化。Fig.3 Schematic representation of the detection of drugs and drug metabolites in latent fingerprints using magnetic nanoparticles.B1: particles coated with recombinant protein A/G; B2: binding a primary antibody to form antibody conjugates of the particles; B3:incubation of a latent fingerprint from a drug user deposited on a glass microscope slide; B4: the color changes of the fingerprint from colorless to yellowish-brown under white light illumination; B5: fluorescence changes shown after a secondary antibody fragment tagged with a fluorescent dye incubated with the fingerprint.

毒品濫用者時(shí)常會(huì)有多種混合藥物濫用的行為，因此僅應(yīng)用單種毒品抗體結(jié)合的磁性材料容易引發(fā)漏檢。在多種免疫磁性材料應(yīng)用于同一枚含毒品指紋的檢測(cè)研究中，David A. Russell 等人將1 枚吸毒者的指紋人為機(jī)械地分成了兩部分，先后應(yīng)用不同的免疫納米磁性材料用在各自的部分中。這種方法也成功地檢測(cè)了吸食兩種毒品者指紋中的殘留代謝物，即海洛因的代謝物嗎啡和可卡因的代謝物苯甲酰愛崗寧[10]。因?yàn)槊庖叽判圆牧显诂F(xiàn)場(chǎng)操作中很容易移除未發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的多余的材料，所以該技術(shù)在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用具有潛在的巨大潛能。在最近的研究中，該團(tuán)隊(duì)又考察了強(qiáng)反射性、非滲透性白瓷表面的指紋，在此客體上潛指紋中的可替寧檢測(cè)已經(jīng)成功應(yīng)用[11]。

5 免疫納米材料分析指紋中混合成分

前面介紹的幾種免疫材料都是一次檢驗(yàn)一種物質(zhì)成分，但如果目標(biāo)物是含有多種成分的化合物，顯然上面的操作過程比較費(fèi)時(shí)。A. V. Dam 等人[12]改進(jìn)了目標(biāo)抗原，取得了重大進(jìn)展，該研究中選擇了人血清白蛋白和人汗腺抗菌肽，這兩種蛋白成分是每個(gè)指紋汗孔中都分泌的成分，可以與多種抗體相結(jié)合，從而使得單枚指紋中多種成分可以同時(shí)通過免疫技術(shù)來檢測(cè)。該研究對(duì)滲透性客體醋酸纖維素膜上的指紋和非滲透性客體載玻片的指紋中的成分進(jìn)行成功標(biāo)記，并在熒光顯微鏡下清晰成像，實(shí)驗(yàn)中同時(shí)提出了免疫納米材料使用方法中應(yīng)該注意的問題，如指紋的提取方法、抗體孵育時(shí)間、沖洗溶劑、沖洗時(shí)間、陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)確證等，從而保證免疫方法的重現(xiàn)性。指紋中的化學(xué)成分與飲食習(xí)慣、指紋形成時(shí)間、性別、毒品濫用情況等有重要的關(guān)聯(lián)性。如飲食中的脫鎂葉綠酸，性別中的荷爾蒙成分，毒品及其代謝物的成分，指紋形成時(shí)間中谷氨酸的成分，均可以制備成復(fù)合抗體與目標(biāo)抗原進(jìn)行特異性結(jié)合。

上述研究成果表明，應(yīng)用免疫技術(shù)與納米技術(shù)聯(lián)合，制備的新型復(fù)合材料，不僅可以提高潛指紋圖像的成像質(zhì)量，還可以對(duì)指紋中的藥物及其代謝物成分進(jìn)行分析，免疫抗體作為指紋成分分析中的生物探針，對(duì)指紋中化學(xué)成分分析開拓了一個(gè)具有巨大潛力的新方向。這種生物探針具有靈敏性好，操作簡(jiǎn)便快速等特點(diǎn)，對(duì)指紋中沉積的微量化學(xué)及藥物成分具有良好的分析性能。同時(shí)應(yīng)用免疫納米技術(shù)提取的指紋檢材是涵蓋形態(tài)與成分的直接證明性非常好的證據(jù)之一。但目前這些熱點(diǎn)研究還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，有關(guān)免疫方法的重現(xiàn)性和非特異性吸附的問題還存在。

相信在不遠(yuǎn)的將來，功能化免疫納米材料—生物探針分析技術(shù)在指紋中藥毒物的分析中將具有巨大潛力。適用于犯罪現(xiàn)場(chǎng)勘查，建立非破壞性的、微型化的、低成本的、快速的潛在指紋及其化學(xué)成分的檢測(cè)分析系統(tǒng)，將有利于犯罪現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，有利于相關(guān)領(lǐng)域諸如運(yùn)動(dòng)員違禁藥物的篩查分析和病人治療診斷的預(yù)測(cè)等。

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