雷飛飛， 王建春， 張詠梅， 孫成祥， 潘金火*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210046；2.張家港市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇蘇州215600）

實時細(xì)胞電子分析應(yīng)用于復(fù)方丹參滴丸質(zhì)量評價的初步研究

雷飛飛1， 王建春2， 張詠梅2， 孫成祥1， 潘金火1*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210046；2.張家港市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇蘇州215600）

目的建立復(fù)方藥物復(fù)方丹參滴丸 （CDDP）的生物活性檢測方法；將細(xì)胞指數(shù)值 （CI）與主要活性成分含有量進(jìn)行相關(guān)性分析，為其質(zhì)量控制提供研究基礎(chǔ)。方法采用實時細(xì)胞電子分析技術(shù) （RTCA），測定樣本對不同細(xì)胞株的IC50值，篩選出對復(fù)方丹參滴丸有特定依賴性的細(xì)胞株，對不同批次復(fù)方丹參滴丸建立時間劑量依賴性細(xì)胞反應(yīng)曲線（TCRPs），以細(xì)胞指數(shù)值 （CI）為考察指標(biāo)，比較各批次藥物的生物活性；測定復(fù)方丹參滴丸主要活性成分含有量，并與生物活性進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果復(fù)方丹參滴丸在一定濃度范圍內(nèi)與空白相比對A549細(xì)胞株的增殖有明顯的抑制作用 （P＜0.05），并有明顯的量效關(guān)系 （r＞0.9）；由TCRPs反映各批次滴丸質(zhì)量穩(wěn)定，但在特定時間點特定的濃度仍有一定差異，今后可用于同種藥物不同批次間的穩(wěn)定性研究；相關(guān)性結(jié)果表明復(fù)方丹參滴丸生物活性與丹參素含有量有顯著性相關(guān) （P＜0.05）。結(jié)論說明本技術(shù)能反映復(fù)方丹參滴丸生物活性，可與化學(xué)成分分析方法結(jié)合共同把關(guān)中藥質(zhì)量。

復(fù)方丹參滴丸；實時細(xì)胞電子分析技術(shù)；質(zhì)量評價；相關(guān)性

中藥質(zhì)量控制與評價的根本目的和最終目標(biāo)是要保證其臨床使用的安全、有效，而現(xiàn)行中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只通過鑒別、檢查、含量測定等手段控制中藥質(zhì)量，這只是立求保證中藥質(zhì)量在化學(xué)層面的均一與穩(wěn)定，中藥質(zhì)量控制與評價模式基本上是 “惟成分論”，既難以保證中藥內(nèi)在質(zhì)量的真正穩(wěn)定、可控，更無法保證其臨床使用的切實安全、有效。生物活性 （效價）測定則是一步到位直接考察藥物安全性和有效性的質(zhì)控方法，中藥質(zhì)量生物控制已成為中藥質(zhì)量控制研究發(fā)展的趨勢［1-4］。

本實驗采用了一種新型的生物活性檢測方法：實時細(xì)胞電子分析技術(shù)（RTCA）。RTCA是一種實時、定量檢測細(xì)胞形態(tài)和分化增殖改變的細(xì)胞阻抗測試微電子傳感器技術(shù)，其以細(xì)胞電子阻抗為原理，系統(tǒng)的核心是把微電子細(xì)胞傳感器芯片整合到表面適于細(xì)胞貼附與生長的細(xì)胞檢測板的底部或細(xì)胞浸潤遷移板的微孔膜上，加入細(xì)胞后，黏附在檢測板底部的細(xì)胞數(shù)量決定了細(xì)胞指數(shù)值的大小，黏附在電極表面的細(xì)胞越多，電阻抗越高，細(xì)胞指數(shù)值越大。通過細(xì)胞指數(shù)值（CI）間接反映藥物對細(xì)胞作用 （促進(jìn)或抑制）的強弱，并可據(jù)此評價藥物的生物活性。該技術(shù)完全有別于傳統(tǒng)的細(xì)胞檢測方法，可以實現(xiàn)無標(biāo)記、全過程動態(tài)跟蹤，在藥物量效關(guān)系指標(biāo)的測定中具有突出優(yōu)勢。當(dāng)前已有部分研究者將這種方法應(yīng)用于中藥研究中，F(xiàn)u等［5］研究表明實時細(xì)胞電子分析技術(shù)能直觀地反應(yīng)出中藥活性成分對細(xì)胞產(chǎn)生的影響，該技術(shù)可應(yīng)用于中藥分析領(lǐng)域。

目前本課題組主要將此方法應(yīng)用于活血化瘀類藥中的單味藥材的質(zhì)量評價［6］。本研究是運用實時細(xì)胞電子分析技術(shù)對活血化瘀類復(fù)方藥物復(fù)方丹參滴丸 （CDDP）進(jìn)行生物檢測，并與化學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，希望為中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供一種具有良好普適性和實用性，能定量表征中藥生物活性的新思路與新方法。

1 儀器和材料

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 （美國Costar公司）；實時細(xì)胞電子分析儀 ［艾森生物 （杭州）有限公司］；Waters2695高效液相色譜儀 （美國沃特世公司）；島津AUX220分析天平（萬分之一）、島津AUW220D分析天平 （十萬分之一）、SCQ-250超聲波清洗器 （上海聲浦超聲波設(shè)備廠）；胎牛血清、磷酸鹽緩沖液 （PBS）、胰酶細(xì)胞消化液 （杭州四季青公司）；RPMI-1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；二甲亞砜（DMSO）等試劑均為國產(chǎn)分析純；對照品丹參素鈉、丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1均購于中國藥品生物制品檢定所，純度均大于98%；肺癌A549等細(xì)胞株購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）；復(fù)方丹參滴丸 （天津天士力制藥集團(tuán)股份有限公司）批次分別為 130121、130420、130315、130301、130105，經(jīng)鑒定符合 《中國藥典》2010年版規(guī)定。

2 試驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肺癌A549細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞（雌激素受體陰性，her2陰性）、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞（雌激素受體陽性，her2陰性）用含10%胎牛血清的RPMI-1640作培養(yǎng)液，置于37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 供試品溶液的制備 取復(fù)方丹參滴丸適量，置于研缽內(nèi)搗碎，取1.35 g，精密稱定，置于25 ML量瓶內(nèi)，加入適量純凈水，超聲30 min溶解，再加入純凈水定容至刻度，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 特定依賴性細(xì)胞株的篩選 RTCA測定樣本的TCRPs（時間劑量依賴性細(xì)胞反應(yīng)曲線）。首先在細(xì)胞檢測板的每個小孔中加入生長介質(zhì)50μL，再加入密度為2×105個/mL的特定細(xì)胞懸液100μL，將此包含一定細(xì)胞數(shù)量的檢測板在室溫放置約30min后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并進(jìn)行連續(xù)讀數(shù)，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到穩(wěn)定時（約18～24 h），除空白組外，其余給藥組將配好的藥液加入小孔內(nèi)，使小孔內(nèi)的藥液終質(zhì)量濃度分別為 0.015、0.044、0.133、0.4、1.2、3.6、10.8 mg/mL，將加好樣的檢測板放入實時細(xì)胞電子分析儀中，設(shè)定好參數(shù)，采用實時細(xì)胞電子分析技術(shù)測出各藥液作用于該細(xì)胞株后所產(chǎn)生的TCRPs，同時系統(tǒng)計算出IC50，通過IC50數(shù)值，篩選出對復(fù)方丹參滴丸具有較好依賴性的細(xì)胞株。

2.4 復(fù)方丹參滴丸主要化學(xué)成分定量測定 參照文獻(xiàn)［8］，采用HPLC法分別同時測定復(fù)方丹參滴丸內(nèi)丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B和三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1的含有量。丹參酚酸類3種成分采用C18柱，流動相A為0.02%磷酸-水，B為0.02%磷酸-乙腈梯度洗脫，0 min 8%B，8 min 18%B，15 min 21%B，40 min 34%B，體積流量1 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫30℃。三七皂苷類3種成分采用C18柱，流動相A為0.01%醋酸-乙腈，B為0.01%醋酸-水梯度洗脫，0 min 20%B，40 min 20%B，55 min 35%B，65min 38%B，體積流量1mL/min，檢測波長203 nm，柱溫30℃。

2.5 不同批號復(fù)方丹參滴丸TCRPs的測定 方法同特定依賴性細(xì)胞株的篩選。測定不同批號的復(fù)方丹參滴丸樣品溶液加入細(xì)胞培養(yǎng)板小孔內(nèi)質(zhì)量濃度分別為0.95、1.18、1.47、1.84、2.3、2.88、3.6 mg/mL的TCRPs。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0分析生物檢測結(jié)果與化學(xué)成分結(jié)果相關(guān)性。

3 結(jié)果

3.1 特定依賴性細(xì)胞株的篩選 采用RTCA測定樣本對不同細(xì)胞株的TCRPs。同一樣本作用于不同細(xì)胞株的TCRPs有較大差異，由RTCA測得的IC50見表1。根據(jù)結(jié)果顯示，復(fù)方丹參滴丸對這4種細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用，但不同細(xì)胞對復(fù)方丹參滴丸的敏感度存在一定差異，MCF-7及A549細(xì)胞的敏感度較MDA-MB-231與HeLa好，但MCF-7較A549過于敏感，經(jīng)分析比較，選擇肺癌A549細(xì)胞進(jìn)行對復(fù)方丹參滴丸的研究。樣本作用于肺癌 A549細(xì)胞株的TCRPs如圖1所示。

圖1 樣本作用于A549細(xì)胞株的TCRPs

RTCA測定的加藥后48 h時的IC50值見表1。

表1 48 h時不同細(xì)胞株的IC50

3.2 復(fù)方丹參滴丸內(nèi)主要化學(xué)成分定量測定 參考文獻(xiàn)，測定了復(fù)方丹參滴丸內(nèi)6種主要成分的含有量，結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方丹參滴丸中主要成分測定結(jié)果 （Mg·g-1）

3.3 RTCA測得的各樣本作用于肺癌A549細(xì)胞株的TCRPs

各樣本作用于肺癌A549細(xì)胞株的TCRPs曲線如圖2～7所示，可以由圖實時觀察出細(xì)胞生長動態(tài)趨勢。從圖2～6可以看出TCRPs曲線有高度相似性，表現(xiàn)出各批次復(fù)方丹參滴丸質(zhì)量的穩(wěn)定性，符合各文獻(xiàn)關(guān)于研究不同批次復(fù)方丹參滴丸穩(wěn)定性的報道。

圖2 樣本批號13021作用于肺癌A549細(xì)胞株的TCRPs

圖3 樣本批號130420作用于肺癌A549細(xì)胞株的TCRPs

圖4 樣本批號130315作用于肺癌A549細(xì)胞株的TCRPs

經(jīng)篩選，各批號復(fù)方丹參滴丸在特定時間點即60 h時，質(zhì)量濃度為0.95～2.88 mg/mL時，細(xì)胞指數(shù)值（CI）與藥液濃度的對數(shù)值lgC呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系，r＞0.9，且在該時間點，各批次不同質(zhì)量濃度復(fù)方丹參滴丸與空白相比對A549細(xì)胞株增殖均有顯著的抑制作用 （P＜0.05），精密度與穩(wěn)定性均較好，所以選取60 h為分析的最佳時間點。60 h時的不同樣本濃度的指數(shù)值lgC與細(xì)胞指數(shù)值CI結(jié)果如表3所示。當(dāng)樣本質(zhì)量濃度為1.84 mg/mL時，不同批次復(fù)方丹參滴丸的CI值均有顯著性差異 （P＜0.05），可區(qū)分出在該質(zhì)量濃度各批次復(fù)方丹參滴丸生物活性有一定差異，從分析結(jié)果可得出在1.84mg/mL時各批次生物活性強弱順序為130301＞130315＞130420＞130121＞130105，此法今后可用于復(fù)方丹參滴丸質(zhì)量評價中的穩(wěn)定性研究中。

圖5 樣本批號130301作用于肺癌A549細(xì)胞株的TCRPs

圖6 樣本批號130105作用于肺癌A549細(xì)胞株的TCRPs

圖7 丹參素對照品作用于肺癌A549細(xì)胞株的TCRPs

《中國藥典》2010年版控制復(fù)方丹參滴丸的指標(biāo)性成分為丹參素，根據(jù)本實驗所測樣品中丹參素的量，配制了與成藥含相同質(zhì)量濃度的丹參素的對照品樣本，圖7發(fā)現(xiàn)，與空白相比，丹參素對A549細(xì)胞增殖抑制作用很小，量效關(guān)系不明顯，說明丹參素的作用不能等同于整個成藥的藥效，丹參素的量也不能全面代表成藥的質(zhì)量。所以控制單一指標(biāo)性成分的含有量，并不能保證藥物的療效，也無法控制藥物的質(zhì)量。

表3 細(xì)胞指數(shù)值CI與不同樣本濃度的指數(shù)值lgC關(guān)系

3.4 生物活性檢測與化學(xué)成分分析結(jié)果的相關(guān)性分析 運用SPSS 16.0將復(fù)方丹參滴丸藥液質(zhì)量濃度為1.84 mg/mL時的細(xì)胞指數(shù)值與各化學(xué)成分含有量進(jìn)行相關(guān)性分析，分析結(jié)果見表4，結(jié)果表明，復(fù)方丹參滴丸的生物活性與丹參素的含有量有顯著性相關(guān) （P＜0.05），與其他成分未見顯著性相關(guān) （P＞0.05）。細(xì)胞指數(shù)值與丹參素含有量的Pearson相關(guān)系數(shù)r=-0.915，P=0.029＜0.05，說明丹參素含有量越高，細(xì)胞指數(shù)值越低，存活的細(xì)胞數(shù)量越少，其抑制細(xì)胞生長的活性越強。一定程度上說明以丹參素含有量作為指標(biāo)性成分控制整個成藥質(zhì)量有一定依據(jù)，但是應(yīng)結(jié)合生物活性測定方法共同把關(guān)中藥質(zhì)量。

表4 復(fù)方丹參滴丸細(xì)胞指數(shù)值與化學(xué)成分相關(guān)性分析

4 討論

實驗過程中比較了復(fù)方丹參滴丸作用于不同細(xì)胞株產(chǎn)生的細(xì)胞曲線有很大的差異，而其不同樣本作用于某種特定細(xì)胞株產(chǎn)生的細(xì)胞曲線有高度相似性。說明復(fù)方丹參滴丸作用于某種特定依賴的細(xì)胞株后可產(chǎn)生獨特專屬的TCRPs曲線。RTCA普適性好、實時在線、客觀靈敏，無需標(biāo)記，對細(xì)胞無創(chuàng)傷，在最接近生理狀態(tài)下獲得檢測結(jié)果，實驗過程中參數(shù)少，數(shù)據(jù)處理快速方便，符合中藥藥效和質(zhì)量評價的客觀現(xiàn)實和發(fā)展方向［8］。

本實驗應(yīng)用實時細(xì)胞電子分析技術(shù)篩選出對活血化瘀類復(fù)方藥復(fù)方丹參滴丸具有特定依賴性的細(xì)胞株，測定不同批次復(fù)方丹參滴丸的細(xì)胞指數(shù)值 （CI），從而評價各批次復(fù)方丹參滴丸的質(zhì)量，并根據(jù)不同的細(xì)胞指數(shù)值 （CI）與該藥物的主要化學(xué)成分進(jìn)行相關(guān)性分析，得出其與丹參素含有量顯著相關(guān)，這說明 《中國藥典》規(guī)定通過測定其中丹參素的含有量控制整體藥物質(zhì)量有一定依據(jù)，深入研究化學(xué)成分分析和生物活性評價來共同把關(guān)中藥質(zhì)量有很大的可行性。

本實驗運用的新型技術(shù)實時細(xì)胞電子分析技術(shù)現(xiàn)主要應(yīng)用于抗腫瘤藥物的篩選，對貼壁類腫瘤細(xì)胞更具有靈敏度，而將該技術(shù)運用于中藥復(fù)方質(zhì)量評價方面仍處于初步階段，經(jīng)查閱大量文獻(xiàn)表明活血化瘀類中藥能改善微循環(huán)，增加血管通透性，抑制腫瘤血管生成［9-10］，本實驗所選擇的活血化瘀類復(fù)方藥物復(fù)方丹參滴丸屬于活血化瘀類藥的代表，實驗設(shè)計時從復(fù)方丹參滴丸活血化瘀的整體作用出發(fā)，利用其對癌細(xì)胞的生長抑制作用，檢測出不同的細(xì)胞指數(shù)值，以期評價藥物的生物活性。實驗中選取了4種貼壁細(xì)胞：肺癌A549細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞 （雌激素受體陰性，her2陰性）、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞 （雌激素受體陽性，her2陰性）進(jìn)行試驗，從中篩選對復(fù)方丹參滴丸有特定依賴性的細(xì)胞株。本研究的關(guān)鍵是正確選擇對被測中藥具有特定依賴和高度靈敏的細(xì)胞株，雖然實驗前期進(jìn)行了大量預(yù)實驗，但細(xì)胞篩選方面仍需做很多工作，在今后的實驗中仍要加大細(xì)胞株的篩選，以期為將此技術(shù)應(yīng)用于中藥質(zhì)量評價方面提供更科學(xué)的依據(jù)。在后續(xù)的研究中，將嘗試應(yīng)用RTCA定量檢測中藥質(zhì)量，并結(jié)合體內(nèi)外藥效學(xué)試驗來進(jìn)一步驗證該方法應(yīng)用于中藥質(zhì)量評價方面的可行性。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）05-1119-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.045

2014-06-05

學(xué)校重點培育課題 （10xpy01）

雷飛飛（1988—），女，碩士生，研究方向為中藥新劑型新技術(shù)。Tel：15105161306，E-mail：leifeifei0831@163.com

*通信作者：潘金火 （1963—），男，教授，研究方向為中藥新劑型工藝及中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。Tel：（025）85811517，E-mail：panjinhuo@ 163.com