王傳博， 方 莉， 王婕瓊，3， 尹婷婷， 童佳兵，3， 楊 程，3， 李澤庚，3*

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科，安徽合肥230601；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)肺病學(xué)科 （國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)學(xué)科），安徽合肥230031；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院呼吸病研究所，安徽合肥230038）

芪白平肺膠囊對(duì)COPD痰瘀阻肺證大鼠肺動(dòng)脈Rock-1表達(dá)的影響

王傳博1，2，3， 方 莉2， 王婕瓊2，3， 尹婷婷2， 童佳兵2，3， 楊 程2，3， 李澤庚2，3*

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科，安徽合肥230601；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)肺病學(xué)科 （國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)學(xué)科），安徽合肥230031；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院呼吸病研究所，安徽合肥230038）

目的探討芪白平肺膠囊對(duì)慢性阻塞性肺疾病 （COPD）痰瘀阻肺證模型大鼠肺動(dòng)脈Rock-1表達(dá)的影響。方法

芪白平肺膠囊；慢性阻塞性肺疾??；痰瘀阻肺證；Rho關(guān)聯(lián)卷曲蛋白激酶

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一種可以預(yù)防和可以治療的常見疾病，其特征是持續(xù)存在的氣流受限。氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展，伴有氣道和肺對(duì)有害顆粒或氣體所致慢性炎癥反應(yīng)的增加［1］。COPD由于長(zhǎng)期的氣道阻塞造成肺泡缺氧及二氧化碳潴留，促使肺血管收縮、肺血管重構(gòu)，從而引起缺氧性肺動(dòng)脈高壓，易發(fā)生右心衰竭和死亡［2］。Rho/Rho激酶信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子包括Rho GTP酶、Rho激酶和肌球蛋白磷酸酶。Rho通過激活下游靶分子-Rho激酶調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)行為和功能，包括收縮、黏附、遷移、增殖、凋亡、基因表達(dá)等。新近研究發(fā)現(xiàn)，肺血管收縮和結(jié)構(gòu)重建與Rho/Rho激酶信號(hào)通路的異常激活有關(guān)［3］。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，以益氣化痰活血之法，應(yīng)用芪白平肺膠囊調(diào)控Rho激酶，干預(yù)COPD肺血管重構(gòu)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量在（230±20）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK2011002）。隨機(jī)分組為正常組、模型組、芪白平肺膠囊低劑量組、芪白平肺膠囊高劑量組、法舒地爾組，每組10只。動(dòng)物飼養(yǎng)室為清潔級(jí)，控制溫度 （22± 2）℃。

1.2 藥物與試劑 芪白平肺膠囊，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)制劑中心提供；法舒地爾注射液2 mL：30 mg，天津紅日藥業(yè)股份有限公司（批號(hào)H20040356）。Western blot一抗試劑：Anti-ROCK1 antibody英國(guó)艾美捷科技有限公司；Anti-Myosin Phosphatase（phospho T853）antibody，英國(guó)艾美捷科技有限公司。二抗試劑：Goat anti-rabbit IgG-HRP上海盈東生物科技有限公司，Goat anti-mouse IgG-HRP上海盈東生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備 動(dòng)物強(qiáng)迫游泳裝置、熏煙箱 （安徽中醫(yī)藥大學(xué)制）；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)低氧裝置 （長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司）；紅梅牌香煙 （含焦油為13 mg，含煙堿為1.1 mg，紅塔卷煙集團(tuán)）。

2 方法

2.1 模型建立 參照肖詩(shī)亮等［4］、李澤庚等［5］的造模方法，建立慢性阻塞性肺疾病痰瘀阻肺證大鼠模型。每天將大鼠放入恒溫 （43±1）℃水槽中強(qiáng)迫游泳30 min，然后置于1 m3熏煙箱內(nèi)香煙熏1 h，最后將大鼠置于常壓低氧裝置內(nèi)7 h，自動(dòng)測(cè)氧儀調(diào)控氧濃度至 （10±0.5）%，造模每周進(jìn)行6 d，第7天暫停，連續(xù)4周。

2.2 給藥方法 每天造模結(jié)束后分別予以藥物灌胃1次，每周進(jìn)行6 d，第7天暫停，連續(xù)4周。正常組、模型組每天生理鹽水灌胃10 mL/kg，芪白平肺膠囊高劑量組每天給藥量為10mL/kg（每1mL含芪白平肺膠囊100mg），芪白平肺膠囊低劑量組每天給藥量為10 mL/kg（每1 mL含芪白平肺膠囊25 mg），法舒地爾組每天劑量10 mL/kg（每1 mL含法舒地爾3 mg）。造模結(jié)束次日進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

2.3 Western blot檢測(cè)Rock-1及磷酸化MYPT-1蛋白表達(dá) 腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，分離肺葉外肺動(dòng)脈，將少量組織約200mg置于培養(yǎng)皿中，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎 （在冰塊上操作，盡量減少蛋白的損失），然后將其移入勻漿器中；加入300μL組織蛋白裂解緩沖液，并且在冰上充分研磨，重復(fù)數(shù)次；充分裂解后用移液器取100μL裂解液于0.5mLEP管中，在40℃下15 000 r/min離心10 min，取上清分裝于0.5 mL離心管中，加等體積的蛋白上樣液，在液氮中速凍后置于-80℃冰箱保存，備用。測(cè)定總蛋白濃度用BSA試劑盒。計(jì)算上樣量，使每孔蛋白上樣量一致。SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將膜用（PBST+5%的脫脂奶粉）封閉后，加入抗HMGB1單抗（稀釋度1∶1 000），室溫孵育2 h，將膜漂洗3次后加入二抗山羊抗兔IgG（稀釋度1∶5 000）室溫孵育1 h，用PBST將膜漂洗3次，加入化學(xué)發(fā)光試劑，X線膠片曝光顯影記錄影像，結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)分析，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，以Rock-1與GAPDH比值作為相對(duì)表達(dá)水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，計(jì)量資料結(jié)果全部采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s）表示，采用單因素方差分析，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后，方差齊時(shí)采用最小顯著法（Least-significant Difference，LSD）進(jìn)行兩兩比較，方差不齊時(shí)用Games-Howell法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 大鼠肺動(dòng)脈ROCK-1以及磷酸化MYPT-1蛋白表達(dá)

芪白平肺膠囊高劑量組、法舒地爾組Rock-1、PMYPT-1積分光密度值較模型組顯著降低 （P＜0.01）；芪白平肺膠囊高劑量組與法舒地爾組Rock-1、P-MYPT-1積分光密度值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。結(jié)果表明，芪白平肺膠囊與法舒地爾均可降低模型大鼠肺動(dòng)脈Rock-1和P-MYPT-1的表達(dá)，進(jìn)而干預(yù)肺血管重構(gòu)。具體見表1、圖1。

表1 各組大鼠肺動(dòng)脈Rock-1和P-MYPT-1吸光度積分比較 （x±s）

圖1 各組大鼠ROCK1、P-MYPT-1的W estern b lot結(jié)果

4 討論

肺血管重構(gòu)是慢性阻塞性肺疾病 （COPD）并發(fā)肺動(dòng)脈高壓的重要病理生理過程，其形成過程較為復(fù)雜，研究認(rèn)為長(zhǎng)期低氧是其發(fā)生的始動(dòng)因素，并涉及神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多個(gè)系統(tǒng)。目前已認(rèn)識(shí)到只有對(duì)COPD肺血管病變的綜合防治才能阻止COPD肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生與發(fā)展，從而達(dá)到早期防治的目的。有研究顯示Rho激酶的活化與血管平滑肌的增生和血管的重構(gòu)有著密切的關(guān)系，參與了動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、肺心病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程［6］，Rho激酶有Rock-1和Rock-2兩個(gè)亞基，研究顯示［7］Rock-1對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的促增殖作用較明顯。

慢性阻塞性肺疾病屬中醫(yī)學(xué) “肺脹”范疇。在長(zhǎng)期研究的基礎(chǔ)上，觀察COPD出現(xiàn)肺血管重構(gòu)、肺動(dòng)脈高壓階段時(shí)表現(xiàn)如下：氣喘胸悶，口唇爪甲青紫，或喘促氣短，動(dòng)則喘甚，肢冷面青，下肢浮腫，小便短少，舌質(zhì)紫暗或有瘀斑，脈細(xì)澀或沉弱等。據(jù)此癥狀表現(xiàn)當(dāng)同于肺脹之痰瘀阻肺證。我們采用 “益氣化痰散瘀”之法，創(chuàng)制 “芪白平肺膠囊”（此方在國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)韓明向臨床經(jīng)驗(yàn)方的基礎(chǔ)上，由李澤庚教授帶領(lǐng)的呼吸學(xué)科經(jīng)過長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)及臨床驗(yàn)證，優(yōu)化而形成）。本方證候乃肺氣虧虛，陽(yáng)氣微弱，痰瘀互結(jié)所致。肺為氣之主，主一身之氣。肺氣虛則宣肅失常而咳嗽、喘促；肺氣虛則治節(jié)失常，水液不循常道凝聚為痰，血液運(yùn)行無(wú)力停滯為瘀，可見咳痰、下肢浮腫；病程日久，氣損及陽(yáng)，陽(yáng)氣虧損則畏寒肢冷；舌脈之象乃氣虛陽(yáng)微痰瘀互結(jié)之征。方中黃芪甘溫而入脾肺經(jīng)，大補(bǔ)脾肺之氣，生曬參補(bǔ)元?dú)?、益脾肺，合為君藥，共奏益氣溫?yáng)之功；川芎活血行氣，使瘀去血行，薤白理氣通陽(yáng)，葶藶子瀉肺平喘，行水消腫，三者共為臣藥；五味子味酸收斂，甘溫而潤(rùn)，能上斂肺氣，下滋腎陰，為治療久咳虛喘之要藥。地龍清肺定喘、通行經(jīng)絡(luò)，合為佐藥。諸藥合用，益氣、溫陽(yáng)、化痰、散瘀。

芪白平肺膠囊經(jīng)長(zhǎng)期臨床應(yīng)用證實(shí)能減輕COPD患者咳、痰、喘癥狀，改善生活質(zhì)量等良好作用［8-10］。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明［11-15］，芪白平肺膠囊可以改善COPD模型大鼠肺功能、右心肥厚、T淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)，緩解低氧血癥等。本實(shí)驗(yàn)表明芪白平肺膠囊可以降低COPD痰瘀阻肺證模型大鼠肺組織Rock-1、P-MYPT-1表達(dá)，減輕肺血管重構(gòu)現(xiàn)象。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）05-1096-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.039

2014-06-15

國(guó)家自然科學(xué)基金 （81202808，81373598）；安徽醫(yī)科大學(xué)校基金 （2012xkj061）

王傳博 （1977—），男，碩士，從事中醫(yī)藥防治肺病研究。

*通信作者：李澤庚 （1962—），男，碩士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，從事中醫(yī)藥防治肺病研究。Tel：（0551）65169269，E-mail：wangcb120@163.com

復(fù)制COPD痰瘀阻肺證大鼠模型，給予芪白平肺膠囊、法舒地爾干預(yù)，Western blot檢測(cè)大鼠肺動(dòng)脈Rock-1及磷酸化MYPT-1蛋白表達(dá)。結(jié)果模型組、芪白平肺膠囊低劑量組Rock-1、P-MYPT-1積分光密度值較正常組顯著增高（P＜0.01）；與模型組相比，芪白平肺膠囊高劑量組、法舒地爾組Rock-1、P-MYPT-1積分光密度值較模型組顯著降低 （P＜0.01）；芪白平肺膠囊低劑量組Rock-1積分光密度值較模型組顯著降低 （P＜0.01）；芪白平肺膠囊低劑量組P-MYPT-1積分光密度值較模型組降低（P＜0.05）；芪白平肺膠囊高劑量組與法舒地爾組Rock-1、P-MYPT-1積分光密度值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論芪白平肺膠囊可降低COPD痰瘀阻肺證模型大鼠Rock-1、P-MYPT-1表達(dá)，減輕肺血管重構(gòu)。