孫 瀚， 范雪梅， 王義明， 王佩瑤， 孟憲生， 梁瓊麟， 羅國安

（1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連116600；2.清華大學化學系，北京100084）

肝癌復方對小鼠肝癌細胞移植瘤的抑制作用初探

孫 瀚1， 范雪梅2*， 王義明2， 王佩瑤1， 孟憲生1， 梁瓊麟2， 羅國安2*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧大連116600；2.清華大學化學系，北京100084）

目的探討肝癌復方及其組方單味藥材對小鼠肝癌細胞移植瘤的抑制作用。方法建立小鼠肝癌H22細胞移植瘤模型，造模小鼠隨機分組后干預給藥，考察給藥周期中小鼠體質量的變化并測量移植瘤質量，計算藥物抑瘤率。結果肝癌復方組小鼠體質量變化最接近空白對照組，且肝癌復方的抑瘤效果最好，抑瘤率為53.85%，優(yōu)于本實驗所選擇的兩個陽性對照藥環(huán)磷酰胺和斑蝥的抑瘤率 （分別為48.46%和17.69%）。結論肝癌復方對小鼠肝癌移植瘤具有較好的抑制作用，且副作用較小。本研究可為肝癌復方臨床治療應用提供實驗依據(jù)。

肝癌復方；肝癌；H22細胞移植瘤模型；抑瘤率

肝癌是世界上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，高居惡性腫瘤排名榜的第五位，且世界各地肝癌發(fā)病率均有上升趨勢［1-2］。肝癌是高度惡性、預后極差的腫瘤之一，未經治療，一般生存期僅為1～4個月［3-4］。

肝癌復方是根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥臨床經驗，由水紅花子、花蕊石、白茅根、薏苡仁四味中藥組成的經驗方，其中水紅花子為君藥。該方具有止痛止血、疏經通絡、健脾祛濕、破癥散結、祛瘀生新等功效，可舒緩肝癌患者臨床癥狀，甚至減小腫瘤體積。因此本研究建立了小鼠肝癌H22細胞實體瘤移植模型，考察肝癌復方對肝癌的治療作用。

1 材料及設備

1.1 細胞株及動物 小鼠肝癌H22細胞株，購自上海復蒙基因生物科技有限公司。雌性SPF級昆明種小鼠130只，體質量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2006-0009，于清華大學生物醫(yī)學中心三層屏障環(huán)境小鼠IVC飼養(yǎng)系統(tǒng)飼養(yǎng)。1.2 藥物 水紅花子藥材（產地廣西，生產批號090901），薏苡仁藥材（產地貴州，批號20090801），購自大連經濟技術開發(fā)區(qū)保健大藥房；花蕊石藥材 （產地廣西，生產批號080201），購自亳州市中藥飲片廠；白茅根藥材 （產地河北，批號20070601），購自大連市同仁堂藥店；肝癌復方由上述藥材組合經遼寧中醫(yī)藥大學藥學院中心實驗室加工而成；環(huán)磷酰胺注射劑（生產批號10042521），復方斑蝥膠囊（生產批號100805），購自北京腫瘤醫(yī)院。

1.3 試劑及儀器 臺盼藍染料 （北京索萊寶科技有限公司，中國）；DMEM，胎牛血清（Gibco公司，美國），DMSO（Amresco公司，美國）。超純水系統(tǒng)（Millipore公司，美國）；MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱（Sanyo公司，日本）；XDS-1B/XJP-6A相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；臺式冷凍離心機（Hettich公司，德國）。

2 實驗方法

2.1 肝癌H22細胞小鼠腹水模型建立［5-7］取健康狀態(tài)良好，已飼養(yǎng)3 d的SPF級昆明小鼠10只，于SPF級動物無菌操作平臺中，無菌吸取肝癌H22細胞懸液0.2 mL，注射于小鼠腹腔。原代肝癌H22細胞小鼠接種后約7 d至10 d內可觀察到腹部膨大，說明接種成功。無菌吸取接種7 d的小鼠肝癌H22細胞腹水混懸液，以無菌生理鹽水按照1∶3比例稀釋，另取SPF級昆明種小鼠，無菌吸取0.2 mL稀釋后的肝癌H22細胞懸液注射入小鼠腹腔，進行傳代。

2.2 小鼠肝癌H22細胞實體瘤模型的建立

2.2.1 肝癌H22細胞混懸液的制備及腋下移植瘤接種 傳代3次，接種7 d，腹水長勢良好的昆明小鼠，脫頸椎處死，利用碘酒、醫(yī)用酒精對小鼠腹部皮膚進行消毒，無菌抽取腹水。臺盼藍染料對腹水中肝癌H22細胞進行活性檢測和計數(shù)，細胞存活率應大于95%，計算腹水中細胞密度。以生理鹽水稀釋腹水，使細胞密度維持在1.0×107個/mL左右。隨機選取10只小鼠作為空白組，對其余80只健康SPF級雌性昆明小鼠進行腋下移植瘤接種。碘酒、醫(yī)用酒精消毒小鼠右腋下皮膚，牙科手術鑷子提起小鼠右腋下皮膚，將0.2 mL稀釋后的腹水溶液注射于小鼠右腋皮下，保證無腹水溶液滲出。

2.2.2 小鼠的分組、給藥與飼養(yǎng) 小鼠接種腋下移植瘤后24 h，將80只接種昆明小鼠隨機分成8組：模型組、西藥陽性對照環(huán)磷酰胺組（2.000 mg/mL）、中藥陽性對照斑蝥組（0.008 mg/mL）、肝癌復方組、水紅花子組、薏苡仁組、花蕊石組、白茅根組，肝癌復方及其單味藥均為40.909mg/mL，每組10只，另有10只空白組小鼠。9組小鼠每天定時灌胃給藥，灌胃劑量為0.5 mL，每日2次，連續(xù)給藥10 d。藥物均用1μL/mLCMC-Na溶液溶解，空白對照組及模型組每次灌胃CMC-Na溶液。分別于給藥后第3天、第6天、第10天稱量小鼠體質量，監(jiān)測其變化。

2.3 樣本采集及指標測定 給藥第9天禁食不禁水，次日，稱量小鼠體質量，脫頸椎處死小鼠。用牙科手術鑷子鑷住小鼠右腋下腫瘤生長部位皮膚，以手術剪刀剪開小鼠皮膚，使移植瘤暴露出來，以牙科手術鑷鈍性剝離移植瘤。用生理鹽水清洗瘤組織3次以除盡組織中的血液并采用濾紙吸去多余生理鹽水，稱量移植瘤質量，記錄瘤質量。按如下公式計算各給藥組的抑瘤率，采用SPSS軟件對實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗，檢驗組間是否存在顯著性差異。

各組抑制率 （%）=［1-（給藥組平均瘤質量/模型組平均瘤質量）］×100%

3 實驗結果

3.1 給藥期間各組小鼠體質量變化趨勢 小鼠體質量變化可以部分反映瘤質量的大小和藥物副作用的大小，各組小鼠在給藥第0天、給藥第3天、給藥第6天、給藥第10天的體質量變化趨勢如圖1所示。各組小鼠在給藥第0天到第6天體質量增長迅速，給藥第6天到第10天體質量增長速度趨緩，甚至略微下降，處于體質量平衡期。其中肝癌復方組和花蕊石組在給藥第6天到第10天體質量最接近空白對照組，說明其對小鼠體質量的影響較小。

圖1 各組小鼠給藥期間體質量變化趨勢圖

3.2 各組藥物對小鼠移植瘤的抑制作用 各組小鼠實驗前后體質量、瘤質量和抑瘤率如表1所示，與模型組相比，環(huán)磷酰胺組、肝癌復方組、水紅花子組、白茅根組、花蕊石組小鼠的抑瘤率顯著降低，說明上述5種藥物對小鼠肝癌移植瘤具有抑制作用。肝癌復方的抑瘤作用最佳，抑瘤率達到53.85%，其次為肝癌復方中的君藥水紅花子，抑瘤率為49.23%。

4 討論

復方因其與組方單味藥相比具有增效減毒的優(yōu)點，不僅是中藥用藥的主要形式［8-9］，也逐步被西方所接受。本研究建立小鼠肝癌H22細胞實體瘤移植模型，考察了肝癌復方及其組成單味藥物對小鼠體質量及瘤質量的影響。

通過各組小鼠給藥期間體質量變化趨勢，發(fā)現(xiàn)小鼠體質量的增加可能與瘤質量的增加相關，肝癌復方組在給藥第6天到第10天體質量最接近空白對照組，說明肝癌復方對移植瘤產生抑制作用較好?；ㄈ锸M的小鼠在給藥第6天到第10天體質量出現(xiàn)小幅下降，可能由于花蕊石為礦物類藥材，含有鎘 （Cr）、砷 （As）等有毒重金屬元素較多［10］、毒性較強，導致小鼠體質量下降。而白茅根組的小鼠體質量在這一時期卻呈現(xiàn)小幅度上升趨勢，推測除瘤質量增加外，白茅根藥材中的有效組分為白茅根多糖類成分，具有較強的免疫調節(jié)作用［11］并能為小鼠提供營養(yǎng)，也可使該組小鼠體質量增加。另外，環(huán)磷酰胺組小鼠體質量變化趨勢有別于其他各組小鼠，且該組小鼠各段時期平均體質量均低于其他各組小鼠。推測其原因可能為環(huán)磷酰胺為烷化劑類抗腫瘤藥物可通過干擾所有快速增生組織的細胞分裂而達到抑制惡性腫瘤的目的，但有較多文獻報道環(huán)磷酰胺具有較強的心臟毒性［12］。有研究表明［7］環(huán)磷酰胺可能引起肝臟巰基和細胞色素P450含有量下降而導致肝臟毒性，推測由于環(huán)磷酰胺的較強毒性導致環(huán)磷酰胺組小鼠體質量低于其他各組，且其體質量變化趨勢有別于其他各組小鼠。肝癌復方組小鼠體質量最接近空白組，說明其對小鼠的生長的影響最小。

表1 各組藥物抑瘤率 （x±s，n=10）

從各給藥組抑瘤率來看，肝癌復方抑瘤率高于臨床證明有較好肝癌治療作用的兩個陽性對照組 （環(huán)磷酰胺組、斑蝥組）抑瘤率，說明肝癌復方對小鼠肝癌移植瘤具有較好的治療作用。肝癌復方的抑瘤率高于其君藥水紅花子組，從增效性角度證明了中藥復方配伍的必要性。水紅花子組的抑瘤率高于其他各單味藥組 （薏苡仁組、白茅根組、花蕊石組），從藥理角度證明了水紅花子在肝癌復方中的君藥地位。

綜上所述，肝癌復方可有效抑制小鼠肝癌細胞移植瘤，且副作用小。本研究可為肝癌復方后續(xù)深入研究及臨床應用提供一定的實驗依據(jù)。

［1］Liu Y，Chang C CH，Marsh G M，et al.Population attributable risk of aflatoxin-related liver cancer：systematic review and meta-analysis［J］.Eu JCancer，2012，48（14）：2125-2136.

［2］Chen JG，Zhang SW.Liver cancer epidemic in China：past，present and future［C］//Seminars in cancer biology.Academic Press，2011，21（1）：59-69.

［3］羅榮城，陳逢生.肝癌2009年臨床研究進展與展望［J］.中國處方藥，2010，94（1）：47-51.

［4］周立新.肝癌靶向藥物治療的研究進展［J］.腫瘤學雜志，2009，15（2）：156-161.

［5］王 晶，偉忠民.秦皮乙素誘導人肝癌細胞SMMC-7721凋亡的機制研究［J］.中成藥，2012，34（11）：2059-2063.

［6］畢 芳，陶文沂，陸震鳴.白首烏提取物對小鼠肝癌細胞H-（22）的抑制作用［J］.中成藥，2007，29（11）：1586-1590.

［7］趙婷秀，陳振發(fā).中藥血清藥理學方法的研究現(xiàn)狀［J］.湖北中醫(yī)學院學報，2003，5（3）：45-46.

［8］羅國安，梁瓊麟，劉清飛，等.復方藥物研發(fā)創(chuàng)新體系展望［J］.世界科學技術 （中醫(yī)藥現(xiàn)代化），2009，11（1）：3-10.

［9］梁瓊麟，羅國安，鄒健強，等.中藥復方新藥創(chuàng)制及技術支撐體系［J］.世界科學技術 （中醫(yī)藥現(xiàn)代化），2008，10（3）：1-7.

［10］趙 晶，孟憲生，包永睿，等.花蕊石煅制后結構變化與元素溶出量差異研究［J］.醫(yī)藥導報，2010，29（5）：565-568.

［11］呂世靜，黃槐蓮，袁漢堯，等.白茅根多糖對人T淋巴細胞免疫調節(jié)效應的研究［J］.中國新藥雜志，2004，13（9）：834-835.

［12］顧穎莉，朱漢威.環(huán)磷酰胺心臟毒性作用的研究進展［J］.上海第二醫(yī)科大學學報，2004，24（9）：772-774.

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：1001-1528（2015）05-1091-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.037

2014-11-19

孫 瀚（1989—），男，碩士生，研究方向為中藥學。Tel：18651535403，E-mail：sun.vic@foxmail.com

*通信作者：范雪梅（1981—），女，博士，高級工程師，研究方向為中藥藥理。Tel：（010）62781688，E-mail：xuemeifan@tsinghua.edu.cn羅國安（1946—），男，教授，研究方向為中醫(yī)藥系統(tǒng)生物學。Tel：（010）62772264，E-mail：luoga@tsinghua.edu.cn