王玉婷， 丁 虹， 邱春玉， 宋 偉， 王 詩*

（1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北咸寧437100；2.武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢430070）

山臘梅葉醇提物對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型小鼠行為學(xué)及腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

王玉婷2， 丁 虹2， 邱春玉1， 宋 偉1， 王 詩1*

（1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北咸寧437100；2.武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢430070）

目的探討山臘梅葉醇提物的抗抑郁作用及可能機(jī)制。方法以氟西汀為陽性對(duì)照組，采用慢性不可預(yù)知性刺激抑郁模型造模，用懸尾試驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)和曠場試驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)研究，并用高效液相色譜-熒光檢測方法測定其腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺 （5-HT）及去甲腎上腺素 （NE）的含有量，觀察模型小鼠給藥前后的變化。結(jié)果模型組小鼠水平活動(dòng)和垂直活動(dòng)均顯著下降，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間和懸尾試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間明顯增加，腦內(nèi)的5-HT及NE含有量降低。山臘梅葉醇提物 （10 g/kg、50 g/kg）能顯著改善模型小鼠的行為學(xué)變化，并增加小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT及NE的含有量。結(jié)論山臘梅葉醇提物通過調(diào)節(jié)中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)具有一定抗抑郁作用。

山臘梅葉；慢性應(yīng)激抑郁模型；抑郁癥；行為學(xué)；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)

抑郁癥是一種容易被忽略的常見精神疾病，主要表現(xiàn)為持續(xù)的情緒低落，嚴(yán)重者可出現(xiàn)自殺念頭和行為。據(jù)WHO保守估計(jì)，抑郁癥在人群中患病率為3%，患者自殺率高達(dá)12%～14%［1］，嚴(yán)重地危害到了社會(huì)和人類健康。目前對(duì)于抑郁癥的發(fā)病機(jī)理研究，認(rèn)為除了心理-社會(huì)因素和遺傳因素外，主要是由于患者體內(nèi)單胺類遞質(zhì)失衡所致。目前使用的抗抑郁藥物大部分都是以單胺遞質(zhì)為主要機(jī)制，如選擇性5-HT再攝取抑制劑氟西?。?］，治療效果明顯，但長期服用產(chǎn)生的副作用不能忽視。因而從天然植物中尋找治療神經(jīng)精神類疾病的藥物成為研究的熱點(diǎn)［3］。

山臘梅Chimonanthus nitens Oliv.為臘梅科臘梅屬植物，又名秋臘梅、毛山茶等，為江西原產(chǎn)植物，具有祛風(fēng)解表、清熱解毒、醒脾化濁之功效［4］。早期的藥理研究主要集中揮發(fā)油及生物堿的藥理作用，如預(yù)防感冒、鎮(zhèn)咳祛痰、消毒抑菌抗炎以及降壓等作用，而其醇提物在精神疾病方面的研究較少［5］，山臘梅葉的醇提物抗抑郁是否有作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究用乙醇提取山臘梅葉得到山臘梅葉醇提物，通過復(fù)制小鼠慢性應(yīng)激抑郁模型，采用懸尾試驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)和曠場試驗(yàn)，觀察山臘梅葉醇提物對(duì)小鼠行為學(xué)的影響，并測定了小鼠腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)5-HT及NE的變化，初步探討了山臘梅葉抗抑郁作用機(jī)制，為其開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性昆明小鼠60只，體質(zhì)量20～25 g（購自湖北省疾控中心，許可證號(hào)NO.42000600002002，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK 2008-0005）。實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)環(huán)境一周。

1.2 藥品與試劑 生理鹽水；鹽酸氟西汀片，批號(hào)2079A，禮來蘇州制藥有限公司生產(chǎn)，臨用前用生理鹽水配制成混懸液；山臘梅葉購自成都荷花池中藥材市場；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器 酶標(biāo)儀，KHB ST-360（上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司）；水浴鍋，HH-600型電熱恒溫水箱 （科華儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE-2002（上海東璽制冷設(shè)備有限公司）；HPLC，LC-10Avp plus（島津公司）。

2 方法和結(jié)果

2.1 山臘梅葉的醇提物 稱取山臘梅葉粉碎，按1∶3的物料比，加入95%的乙醇，攪拌均勻，70℃回流2 h，倒出回流液，再次1∶3的物料比，加入95%的乙醇70℃回流2 h，收集兩次回流液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成浸膏狀得到山臘梅醇提物，配成生藥量為10 g/kg的低劑量和50 g/kg的高劑量溶液。

2.2 小鼠分組造模及給藥

2.2.1 小鼠分組及給藥 正常昆明雄性小鼠60只，24 h禁水不禁食后，給予1%蔗糖水，測定1 h內(nèi)的消耗量。根據(jù)蔗糖水消耗量隨機(jī)分成5個(gè)組，每組12只，即空白組、模型組、山臘梅提取物高 （50 g/kg）、低 （10 g/kg）劑量組、陽性藥氟西汀組 （2 mg/kg）。造模同時(shí)給藥，每日1次，連續(xù)給藥21 d。各組均按1.0mL/100 g灌胃給藥。模型組和空白組給予生理鹽水。

2.2.2 小鼠造模 參照文獻(xiàn)［6-7］方法，4℃ 冰水游泳（5min）、45℃熱烘 （5 min）、夾尾 （1 min）、潮濕飼養(yǎng)（潮濕墊料）、晝夜顛倒 （24 h），禁食 （24 h），禁水 （24 h）等刺激隨機(jī)安排到21 d內(nèi)，每日于下午15∶00給予1種刺激，各組動(dòng)物均自由飲食。室溫 （24±1）℃，相對(duì)濕度 （60±10）%。

2.3 行為學(xué)測定 在第7天、第14天、第21天進(jìn)行曠場試驗(yàn)、懸尾試驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)。

2.3.1 曠場試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［8］，取雄性小鼠60只，隨機(jī)分成5組，每組12只。按 “2.2.1”項(xiàng)所寫，每天13∶00時(shí)分別灌胃給藥。分別在第7、14和21天給藥1 h后進(jìn)行曠場試驗(yàn)。在安靜環(huán)境中，將小鼠放入敞箱中心格中，記錄5 Min運(yùn)動(dòng)情況 （直立次數(shù)、水平格數(shù)）。直立次數(shù)以雙前爪同時(shí)抬起為準(zhǔn)；水平穿格數(shù)以三只爪同時(shí)在一個(gè)格子為穿越一個(gè)格子。

2.3.2 懸尾試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組、給藥劑量和給藥時(shí)間等與“2.3.1”項(xiàng)一致。分別在第7、14和21天給藥1 h后進(jìn)行懸尾試驗(yàn)，將小鼠尾端1 cm的部位貼在一木盒上，頭朝下，使小鼠前后左右均無攀抓的地方，一段時(shí)間后小鼠活動(dòng)減少，記錄6min，其中前1 min不作記錄，記錄后5min內(nèi)小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間［9］。

2.3.3 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組、給藥劑量和給藥時(shí)間等與 “2.3.1”項(xiàng)一致。分別在第7、14、21天給藥1 h后進(jìn)行強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)。將小鼠置于一個(gè)透明容器內(nèi) （高度為20 cm，直徑為14 cm），并保持水位在12 cm，水溫 （25±2）℃?？偣苍谒杏? min，記錄后5 min內(nèi)小鼠的不動(dòng)時(shí)間（不動(dòng)時(shí)間定義為小鼠在水上漂浮沒有四肢的掙扎，偶爾移動(dòng)僅是保持頭部露在水面以上）［10］。

2.4 山臘梅葉醇提物對(duì)慢性應(yīng)激型小鼠腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)的影響 各組小鼠分別在在實(shí)驗(yàn)第21天強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)完成后，斷頭處死，迅速在冰上剝離大腦，稱定質(zhì)量后置組織冷凍管中用液氮快速冷凍后，放入-70℃冰箱保存至測定。根據(jù)大腦組織的質(zhì)量，加入預(yù)冷的0.1 mol/L過氯酸（內(nèi)含0.3 mmol EDTA二鈉和0.5 mmol亞硫酸鈉），2μg/ mL DHBA，超聲勻漿，10 000 r/min離心10 min，上清液用于5-HT測定［11］。采用高效液相色譜-熒光檢測器系統(tǒng)進(jìn)行測定，色譜條件為：色譜柱為4 mm×250 mm，Nova-pak C18，5μm（武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供）；流動(dòng)相為15 mmol鹽酸-乙酸鈉緩沖液，pH 4.0（內(nèi)含0.5%三乙胺，0.5 mmol EDTA二鈉），體積流量0.6 mL/min。

3 結(jié)果

3.1 曠場試驗(yàn) 造模給藥后，模型組的水平和垂直自主活動(dòng)都顯著低于空白組。與模型組相比，山臘梅葉醇提物低、高劑量組明顯增加了大鼠曠場試驗(yàn)水平穿格數(shù)和直立次數(shù)，但隨著給藥時(shí)間的增加，效果逐漸減弱。詳見表1和表2。

表1 山臘梅葉醇提物對(duì)曠場試驗(yàn)中小鼠水平方向移動(dòng)格數(shù)的影響 （x±s，n=12）

表2 山臘梅葉醇提物對(duì)曠場試驗(yàn)中小鼠直立次數(shù)的影響 （x±s，n=12）

3.2 懸尾試驗(yàn) 與空白組相比，模型組懸尾不動(dòng)時(shí)間顯著增加；與模型組相比，山臘梅葉醇提物低、高劑量組懸尾不動(dòng)時(shí)間顯著減少，見表3。注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表3 山臘梅葉醇提物在TST中對(duì)小鼠不動(dòng)時(shí)間的影響 （x±s，n=12）

3.3 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)的不動(dòng)時(shí)間 模型組小鼠不動(dòng)時(shí)間較正

常對(duì)照組顯著延長；與模型組相比，山臘梅葉醇提物低、高劑量組小鼠的不動(dòng)時(shí)間較模型組均顯著縮短，具體數(shù)據(jù)見表4。

表4 山臘梅葉醇提物在FST中對(duì)小鼠不動(dòng)時(shí)間的影響 （x±s，n=12）

3.4 山臘梅葉醇提物對(duì)慢性應(yīng)激型小鼠腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)的影響 與空白組比較，模型組小鼠大腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT與NE含有量明顯降低 （P＜0.01），與模型組比較，山臘梅葉醇提物低、高劑量組和氟西汀組小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT及NE含有量明顯升高 （P＜0.05），見表5。

表5 山臘梅葉醇提物對(duì)小鼠大腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)的影響（x±s，n=12）

3 討論

抑郁癥屬于情感性精神障礙，又被稱為 “情緒感冒”，是一種以顯著而持久的心境低落為主要特征的綜合征，對(duì)于社會(huì)和個(gè)人都能造成嚴(yán)重危害。目前，世界約有一億人患有抑郁癥，且數(shù)量有增無減，抑郁癥將成為本世紀(jì)一種相當(dāng)流行的病癥。因此抑郁癥發(fā)病機(jī)制的研究對(duì)于尋找防治抑郁癥的有效方法和手段具有十分重要的意義。而在天然藥物中尋求具有抗抑郁活性的成分具有重要的現(xiàn)實(shí)和理論價(jià)值。本研究通過復(fù)制小鼠慢性應(yīng)激模型，觀察山臘梅葉醇提物對(duì)該模型的影響，進(jìn)而驗(yàn)證山臘梅醇提物的抗抑郁作用，為山臘梅的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)藥理學(xué)研究。

小鼠在經(jīng)歷一系列較為嚴(yán)重的應(yīng)激因子 （如電擊、剝奪食水、冷水浸泡、隔離和反轉(zhuǎn)晝夜節(jié)律等）后表現(xiàn)出自主活動(dòng)能力下降，而在應(yīng)激過程中同時(shí)接受抗抑郁劑治療的動(dòng)物活動(dòng)能力則與正常對(duì)照相同。此模型是模擬抑郁癥的環(huán)境誘因，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物模型的行為特征改變，這些變化均與內(nèi)源性抑郁癥狀相似，因此作為抑郁模型具有較高的價(jià)值，可用于抗抑郁藥物的篩選及抑郁癥病理生理機(jī)制的研究。在曠場試驗(yàn)中，水平穿越格數(shù)和直立次數(shù)反映了動(dòng)物的活動(dòng)度和對(duì)新鮮環(huán)境的適應(yīng)程度；在強(qiáng)迫游泳及懸尾模型中，小鼠在應(yīng)激條件下，經(jīng)掙扎后出現(xiàn)絕望表現(xiàn)即不動(dòng)狀態(tài)，模擬了人的抑郁狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，山臘梅葉醇提物不僅可以增加小鼠曠場試驗(yàn)的直立次數(shù)、穿越格子數(shù)，而且可以減少強(qiáng)迫游泳及懸尾試驗(yàn)中由于模型造成的不動(dòng)時(shí)間延長，表明其具有一定的抗抑郁效果。

盡管抑郁癥的發(fā)病機(jī)制尚不明確，假說眾多，但單胺假說的地位一直極為重要，現(xiàn)有的抗抑郁劑大多數(shù)都是在此基礎(chǔ)上研發(fā)而成。單胺假說認(rèn)為抑郁癥的生物學(xué)基礎(chǔ)是腦內(nèi)單胺遞質(zhì)5-HT和 （或）NE的缺乏［12］。單胺類遞質(zhì)系統(tǒng)主要包括5-HT系統(tǒng)、NE系統(tǒng)和多巴胺（DA）系統(tǒng)，控制著睡眠、食欲、情緒和性欲等生理活動(dòng)，而遞質(zhì)的改變影響其相應(yīng)功能，從而導(dǎo)致各種抑郁癥狀的出現(xiàn)。目前有研究證實(shí)，大腦神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的缺乏與抑郁癥的發(fā)生有直接關(guān)系［13］；而NE不足則可導(dǎo)致精神遲滯。多數(shù)抗抑郁藥物，如單胺氧化酶抑制劑（MAOI），選擇性5-HT再攝取抑制劑 （SSRI），選擇性去甲腎上腺素再攝取抑制劑 （NARI），選擇性5-HT及去甲腎上腺素再攝取抑制劑 （SNRI）等都可升高腦內(nèi)突觸部位一種或多種單胺遞質(zhì)的水平。本實(shí)驗(yàn)顯示慢性應(yīng)激小鼠大腦內(nèi)5-HT及NE含有量明顯降低，山臘梅葉醇提物能提高大腦內(nèi)5-HT、NE的含有量 （P＜0.05）。表明山臘梅葉醇提物對(duì)大腦內(nèi)的單胺神經(jīng)遞質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用，可能是其抗抑郁作用的機(jī)制之一。但山臘梅葉醇提物高、低劑量之間的抗抑郁效果并沒有顯著的差異，因此，對(duì)山臘梅葉最適抗抑郁癥劑量的篩選還有待進(jìn)一步的研究。

近來，天然產(chǎn)物中獲得的黃酮類成分的抗抑郁藥理活性受到關(guān)注［14］。黃酮類化合物是廣泛存在于自然界的一類多酚化合物，有許多潛在的藥用價(jià)值。除了具有較強(qiáng)的抗氧化活性外，研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物能影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有鎮(zhèn)靜和抗抑郁作用［15］。研究表明山臘梅葉的主要活性成分為黃酮、揮發(fā)油及生物堿類物質(zhì)［16］，而揮發(fā)油及生物堿多用于如預(yù)防感冒、鎮(zhèn)咳祛痰、消毒抑菌抗炎以及降壓等的作用研究。所以，我們猜測山臘梅葉醇提物在小鼠慢性應(yīng)激抑郁癥動(dòng)物模型上表現(xiàn)出的有效性，以及對(duì)腦內(nèi)5-HT的調(diào)節(jié)作用可能是黃酮類物質(zhì)。黃酮類物質(zhì)包括蘆丁、槲皮素和山柰酚等，其抗抑郁作用是某一種黃酮類成分，或者是幾種的綜合作用，這還有待于進(jìn)一步深入研究。

［1］Saveanu R V，Nemeroff C B.Etiology of depression：genetic and environmental factors［J］.Psychiatr Clin North Am，2012，35（1）：51-71.

［2］Van Praag H.Serotonin-related，anxiety/aggression-driven， stressor-precipitated depression.A psycho-biological hypothesis［J］.Eur Psychiatry，1996，11（2）：57-67.

［3］毛慶秋，黃 真.中藥治療抑郁癥的作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國中藥雜志，2007，32（10）：877-880.

［4］謝宗萬，梁愛華.全國中草藥匯編［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996.

［5］李莎莎，舒任庚.山臘梅化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展［J］.華西藥學(xué)雜志，2009，24（2）：198-200.

［6］Willner P，Towell A，Sampson D，et al.Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress，and its restoration by a tricyclic antidepressant［J］.Psychopharmacology（Berl），1987，93（3）：358-364.

［7］Richardson JS.Animal models of depression reflect changing views on the essence and etiology of depressive disorders in humans［J］.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，1991，15（2）：199-204.

［8］Katz R J，Roth K A，Carroll B J.Acute and chronic stress effects on open field activity in the rat：imp lications for amodel of depression［J］.Neurosci Biobehav Rev，1981，5（2）：247-251.

［9］Kirby L G，Allen A R，Lucki I.Regional differences in the effects of forced swimming on extracellular levels of 5-hydroxytryptamine and 5-hydroxyindoleacetic acid［J］.Brain Res，1995，682（1）：189-196.

［10］Porsolt R D，Bertin A，Jalfre M.Behavioral despair inmice：a primary screening test for antidepressants［J］.Arch Int Pharmacodyn Ther，1977，229（2）：327-336.

［11］王景霞，張建軍，李 偉，等.白芍提取物對(duì)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠行為學(xué)及大腦皮質(zhì)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（11）：1895-1897.

［12］RacagniG，Brunello N.Physiology to functionality：the brain and neurotransmitter activity［J］.Int Clin Psychopharmacol，1999，14（Suppl1）：S3-S7.

［13］潘玉芹，林文娟.海馬5-羥色胺系統(tǒng)與抑郁癥［J］.中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2006，15（4）：379-380.

［14］龔金炎，吳曉琴，毛建衛(wèi).黃酮類化合物抗抑郁作用的研究進(jìn)展［J］.中草藥，2011，42（1）：195-200.

［15］周 新，李宏杰.黃酮類化合物的生物活性及臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國新藥雜志，2007，16（5）：350-355.

［16］張尊敬，劉忠達(dá).山臘梅的成分及藥理作用研究近況［J］.浙江中醫(yī)雜志，2009，44（11）：849-850.

R285.5

：B

：1001-1528（2015）05-1087-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.036

2014-03-12

湖北省教育廳 （XD2014282）

王玉婷（1989—），女，碩士，助教，從事藥理學(xué)研究。E-mail：intyuwang1@163.com

*通信作者：王 詩（1984—），女，博士，講師，從事藥理學(xué)研究。E-mail：wangshi413@gmail.com