楊 艷， 易進(jìn)海， 劉云華， 黃志芳， 劉玉紅， 陳 燕

（1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川成都610041；2.瀘州醫(yī)學(xué)院，四川瀘州646000）

一測多評(píng)法測定中成藥中洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯

楊 艷1，2， 易進(jìn)海1*， 劉云華1， 黃志芳1， 劉玉紅1， 陳 燕1

（1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川成都610041；2.瀘州醫(yī)學(xué)院，四川瀘州646000）

目的以丁苯酞為內(nèi)標(biāo)一測多評(píng)法測定都梁滴丸、白帶丸、血府逐瘀膠囊中洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯。方法

都梁滴丸；白帶丸；血府逐瘀膠囊；相對(duì)校正因子；洋川芎內(nèi)酯A；藁本內(nèi)酯；丁苯酞；一測多評(píng)

川芎、當(dāng)歸在中成藥中廣泛應(yīng)用，二者的化學(xué)成分和功效有相似之處，其揮發(fā)油成分為苯酞類衍生物，與川芎、當(dāng)歸的功能主治密切相關(guān)，主要代表性有效成分為藁本內(nèi)酯（ligustilide）和洋川芎內(nèi)酯A（senkyunolide A）［1-3］，故應(yīng)測定該類成分的含有量以便客觀評(píng)價(jià)和控制中成藥的質(zhì)量。目前文獻(xiàn)報(bào)道均是以洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯為對(duì)照品，采用外標(biāo)法測其二者的含有量［4-6］；但洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯穩(wěn)定性差，不宜作為法定的含量測定用對(duì)照品。本課題組前期報(bào)道了以穩(wěn)定的丁苯酞作為替代對(duì)照品，采用雙波長檢測，同時(shí)測定川芎中丁苯酞和藁本內(nèi)酯的量，但丁苯酞的含有量很低［7］。本實(shí)驗(yàn)以含川芎和/或當(dāng)歸的都梁滴丸、白帶丸和血府逐瘀膠囊為代表性藥物，進(jìn)一步改進(jìn)分析方法，以丁苯酞為內(nèi)標(biāo)，采用單波長檢測，“一測多評(píng)”法測定主要有效成分洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯的量，并與外標(biāo)法測定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明該方法簡便適用可行，為中成藥中川芎、當(dāng)歸的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜系統(tǒng)；Waters1525-2487高效液相色譜系統(tǒng)，Breeze液相色譜工作站；Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)；Agilent Eclipse XDB-C18（4.6mm×150mm，5μm），Phenomenex Luna C18（4.6 mm×150 mm，5μm），Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm），島津AUX220型萬分之一電子天平，島津AUW220D型十萬分之一電子天平，KQ-300B型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

丁苯酞對(duì)照品 （批號(hào)101035-200901）購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯對(duì)照品由本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)核磁共振波譜法［8-9］測定其純度分別為 90.61%和92.80%。都梁滴丸樣品 （批號(hào)分別為 140403，131004，120702）為市售品 （北京九龍制藥有限公司），白帶丸樣品 （批號(hào)分別為 1401083，130118，130606）為市售品 （河北萬歲藥業(yè)有限公司），血府逐瘀膠囊樣品 （批號(hào)分別為C03033，D03041，C03208）為市售品 （天津宏仁堂藥業(yè)有限公司）。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定波長的選擇 取丁苯酞、洋川芎內(nèi)酯A和藳本內(nèi)酯對(duì)照品，在200～400 nm范圍內(nèi)掃描，測得其紫外吸收光譜見圖1。由圖1可見，丁苯酞、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯三者在波長280 nm處均有較大吸收，故采用280 nm單波長檢測測定。

圖1 丁苯酞 （A）、洋川芎內(nèi)酯A（B）和藁本內(nèi)酯 （C）的紫外吸收?qǐng)D譜Fig.1 UV spectruMof butylphthalide（A），senkyunolide A（B）and ligustilide（C）

2.2 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（52∶48）；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣量10μL；檢測波長280 nm。上述色譜條件下，各成分分離良好，陰性樣品無干擾，結(jié)果見圖2。

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備 稱取對(duì)照品丁苯酞、藁本內(nèi)酯和洋川芎內(nèi)酯A適量，精密稱定，加無水乙醇分別制成每1 mL含丁苯酞1.994 mg，藁本內(nèi)酯0.806 7 mg，洋川芎內(nèi)酯A 0.434 6 mg的溶液，作為貯備液。分別精密量取上述對(duì)照品貯備溶液各1 mL，置同一10 mL棕色量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液 （每1 mL含丁苯酞199.4μg，含藁本內(nèi)酯80.67μg，含洋川芎內(nèi)酯A 43.46μg）。

2.4 供試品溶液的制備 都梁滴丸、白帶丸粉碎過三號(hào)篩，取二者粉末和血府逐瘀膠囊內(nèi)容物約1～1.5 g，精密稱定，分別置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ML，稱定質(zhì)量，超聲處理（100 W，40 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，置棕色瓶中，即得供試品溶液。

2.5 陰性樣品溶液的制備 按照都梁滴丸、白帶丸和血府逐瘀膠囊的處方和制法，制成不含川芎、當(dāng)歸的陰性樣品，并按供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

圖2 混合對(duì)照品 （A）、都梁滴丸 （B）、都梁滴丸陰性 （C）、白帶丸 （D）、白帶丸陰性 （E）、血府逐瘀膠囊（F）及血府逐瘀膠囊陰性（G）HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograMs ofMixture reterence substances（A），Duliang Dropping Pills（B），negative saMp le of Duliang Dropping Pills（C），Baidai Pills（D），negative saMp le of Baidai Pills（E），Xuefu Zhuyu Capsules（F）and negative saMp le of Xuefu Zhuyu Capsu les（G）

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察、檢測限和定量限測定 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按 “2.2”項(xiàng)下方法分別測定丁苯酞、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯的峰面積，重復(fù)3次，取平均值。以進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。當(dāng)信噪比 （S/N）為3時(shí)的被測物質(zhì)量為檢測限，信噪比 （S/N）為10時(shí)的被測質(zhì)量為定量限，據(jù)此測得丁苯酞、洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯的檢測限和定量限見表1。

表1 3個(gè)成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限和定量限Tab.1 L iner correlation，liMit of detection and liMit of quantitation of three coMponents

2.6.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按 “2.2”項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯峰面積的RSD均為0.1%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫下放置，分別在0、2、4、6、8、24 h進(jìn)樣測定峰面積，洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯峰面積的RSD均為1.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)測定，結(jié)果穩(wěn)定。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取都梁滴丸粉末 （批號(hào)140403）1 g，精密稱定，共6份，按 “2.4”項(xiàng)下方法制備樣品，測定，洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯的平均含有量分別為0.069 3%和0.067 8%，RSD分別為0.6%和1.8%。表明該方法的重復(fù)性良好。2.6.5 加樣回收試驗(yàn) 取都梁滴丸粉末 （批號(hào)140403）0.5 g，精密稱定，共6份，分別精密加入含洋川芎內(nèi)酯A（0.3520 mg/mL）和藁本內(nèi)酯（0.339 0 mg/mL）的對(duì)照品溶液各1 mL，按“2.4”項(xiàng)下方法制備樣品，測定并計(jì)算加樣回收率，洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯的平均回收率分別為99.7%和100.0%，RSD分別為1.2%和1.5%。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Result of recovery tests（n=6）

2.6.6 相對(duì)校正因子的測定 以丁苯酞作為內(nèi)標(biāo)物，按照公式相對(duì)校正因子 （f）=（Ai×Cr）/（Ar×Ci）［7］（Ai為替代對(duì)照品的峰面積；Ar為真實(shí)對(duì)照品的峰面積；Ci為替代對(duì)照品的濃度；Cr為真實(shí)對(duì)照品的濃度），計(jì)算6個(gè)不同進(jìn)樣量時(shí)洋川芎內(nèi)酯A對(duì)丁苯酞的校正因子f1和藁本內(nèi)酯對(duì)丁苯酞的校正因子f2的平均值。結(jié)果見表3。

2.6.7 校正因子的重現(xiàn)性考察 采用Agilent E-clipse XDB-C18色譜柱，分別考察了Agilent1200、Agilent1100和Waters1525-2487液相色譜系統(tǒng)；采用Agilent1200液相色譜儀，考察了3種不同型號(hào)的色譜柱（Agilent Eclipse XDB-C18、Phenomenex Luna C18、Agilent Zorbax SB-C18）；采用Agilent1200、Agilent Eclipse XDB-C18柱分別考察了不同柱溫 （25℃、30℃、35℃）、不同儀器體積流量（0.9、1.0、1.1 mL/min）對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見表4，表明相對(duì)校正因子的重現(xiàn)性良好（RSD＜2%）。

表3 相對(duì)校正因子計(jì)算結(jié)果 （n=3）Tab.3 Result of the relative correction factors

表4 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察結(jié)果 （n=3）Tab.4 Reproducibility of relative correction factors（n=3）

2.6.8 待測組分色譜峰的定位 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，只使用丁苯酞作為對(duì)照品時(shí)，引入兩組分的相對(duì)保留時(shí)間值并結(jié)合色譜峰的紫外吸收光譜特征可以作為定位藁本內(nèi)酯峰和洋川芎內(nèi)酯A峰的標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)考察了在不同品牌儀器和不同規(guī)格色譜柱中的重復(fù)性，得到洋川芎內(nèi)酯A對(duì)丁苯酞的相對(duì)保留時(shí)間的平均值為0.91，藁本內(nèi)酯對(duì)丁苯酞的相對(duì)保留時(shí)間的平均值為1.64，RSD分別為0.4%和1.3% （n=6）。表明不同品牌色譜儀和不同規(guī)格的色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間值的影響不大，因此，可以根據(jù)相對(duì)保留時(shí)間值來定位藁本內(nèi)酯峰和洋川芎內(nèi)酯A色譜峰。

2.7 一測多評(píng)法與外標(biāo)法測定結(jié)果的比較 本實(shí)驗(yàn)以外標(biāo)法和一測多評(píng)法分別測定3批都梁滴丸、白帶丸、血府逐瘀膠囊中洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯的含量，結(jié)果見表5。表明一測多評(píng)法計(jì)算值與外標(biāo)法實(shí)測值之間沒有明顯差異，說明建立的相對(duì)校正因子具有很好的重現(xiàn)性和可信度，在定量用對(duì)照品缺乏情況下，可以通過一測多評(píng)法實(shí)現(xiàn)對(duì)都梁滴丸、白帶丸和血府逐瘀膠囊中洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯含有量的同步測定。

表5 兩種方法測得中成藥中洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯結(jié)果比較（%，n=3）Tab.5 CoMparision of contents of ligustilide and senkyunolide A in Chinese patent medicines by two methods（%，n=3）

3 討論

采用 “一測多評(píng)”法進(jìn)行多成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)，各成分相對(duì)校正因子的確定和待測成分色譜峰的定位很重要。本實(shí)驗(yàn)考察了影響相對(duì)校正因子重現(xiàn)性的儀器、色譜柱、柱溫和體積流量，結(jié)果表明相對(duì)校正因子具有較好的可靠性。在進(jìn)行待測成分色譜峰定位時(shí)，分別對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留值進(jìn)行了考察，表明相對(duì)保留值重現(xiàn)性較好，RSD小于5%，因此采用相對(duì)保留值作為定位待測成分色譜峰的依據(jù)。此外，還可以與川芎、當(dāng)歸對(duì)照藥材的色譜峰進(jìn)行比對(duì)，以及進(jìn)一步驗(yàn)證待測成分的紫外吸收光譜，確保色譜峰定位準(zhǔn)確可靠。

都梁滴丸由川芎、白芷組成，血府逐瘀膠囊由川芎、當(dāng)歸等十一味中藥組成，白帶丸由當(dāng)歸等五味中藥組成。都梁滴丸和血府逐瘀膠囊能同時(shí)檢測出洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯，而白帶丸僅檢測出藁本內(nèi)酯，與文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)歸不含洋川芎內(nèi)酯A相符［8-9］。本實(shí)驗(yàn)采用法定對(duì)照品丁苯酞為內(nèi)標(biāo)，同時(shí)測定中成藥中洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯的量，該方法簡便適用可行，解決了對(duì)照品不穩(wěn)定的難題。

洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯對(duì)照品不穩(wěn)定，制備后應(yīng)立即使用或置-20℃短期保存，臨用時(shí)應(yīng)重新標(biāo)定其含量。由于二者穩(wěn)定性差，為油狀物質(zhì)，在制備過程中常殘留部分溶劑或降解產(chǎn)物，HPLC峰面積歸一化法測得的純度往往偏高，因此，本實(shí)驗(yàn)采用核磁共振波譜法［10-11］測得洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯對(duì)照品的絕對(duì)含有量分別為90.61%和92.80%，進(jìn)行相對(duì)校正因子測定，保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

［1］陳凌霞，王 玲.當(dāng)歸川芎的揮發(fā)油成分和藥用功效對(duì)比研究［J］.河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，40（1）：103.

［2］金玉青，洪遠(yuǎn)林，李建蕊，等.川芎的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展［J］.中藥與臨床，2013，4（3）：45.

［3］王 玎，馬逾英，張 利，等.三個(gè)不同產(chǎn)地的川芎與其近緣植物藳本的揮發(fā)油成分對(duì)比分析［J］.中國現(xiàn)代中藥，2009，11（7）：20-22.

［4］項(xiàng)海燕.川芎6種活性成分的含量測定［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009，5（11）：39.

［5］郭小藤，趙睜睜，容 蓉，等.兩種方法測定川芎油中藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A和正丁基苯酞的含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（13）：97.

［6］溫學(xué)遜，牛 研，王書芳.當(dāng)歸不同藥用部位活性成分含量的HPLC分析方法及特征圖譜研究［J］.藥物分析雜志，2014，34（2）：318-320.

［7］劉云華，易進(jìn)海，邵華武，等.替代對(duì)照品法同時(shí)測定川芎中丁苯酞和藁本內(nèi)酯的含量［J］.藥物分析雜志，2012，32（5）：759.

［8］宋秋月，付迎波，劉 江，等.當(dāng)歸的化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2011，42（10）：1900-1903.

［9］田 璐，閆海霞，傅欣彤，等.一測多評(píng)法同時(shí)測定川芎、當(dāng)歸飲片中多種化學(xué)成分的含量［J］.藥物分析雜志，2014，34（5）：852-853.

［10］易進(jìn)海，劉云華，陳 燕，等.核磁共振波譜法測定藁本內(nèi)酯對(duì)照品的含量［J］.藥物分析雜志，2010，30（4）：681.

［11］郗紅娟，靳 嵐.核磁共振波譜法在藥物分析中的應(yīng)用［J］.藥物生物技術(shù)，2013，20（5）：453.

DeterMination of senkyunolide A and ligustilide in Chinese tranditional patent medicines by QAMS

YANG Yan1，2， YI Jin-hai1*， LIU Yun-hua1， HUANG Zhi-fang1， LIU Yu-hong1， CHEN Yan1
（1.Sichuan Provincial Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu 610041，China；2.Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China）

AIMTo take butylphalide as the internal reference standard to establish an HPLCmethod for simultaneously determining senkyunolide A and ligustilide in Duliang Dropping Pills，Baidai Pills and Xuefu Zhuyu Capsules using quantitative analysis ofmulti-components by singlemarker（QAMS）.METHODSThe analyses ofmethanolic extracts of above pills and capsules were performed on Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）column with methanol-water（52∶48）asmobile phase，the relative correction factors of ligustilide and senkyunolide A weremeasured and their reproducibility examined under different conditions，and the comparison wasmade with external standardmethod.RESULTSThe contents of senkyunolide A and ligustilide in Duliang Dropping Pills and Xuefu Zhuyu Capsuleswere found，only ligustilide in Baidai Pillswas detected.The relative correction factors presented good reproducibility on Agilent Eclipse XDB-C18，Phenomenex Luna C18and Agilent Zorbax SB-C18columns.There was no significant difference between QAMS and external standard method.CONCLUSIONThe adopted QAMS can be applied to the quality control of Chuanxiong Rhzoma and Angelicae sinensis Radix in aid of solving the instability of senkyunolide A and ligustilide.

Duliang Dropping Pills；Baidai Pills；Xuefu Zhuyu Capsules；relative correction factor；senkyunolide A；ligustilide；butylphalide；quantitative analysis ofmulti-components by single marker（QAMS）

R927.2

：A

：1001-1528（2015）05-1000-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.016

2014-10-19

2015年版中國藥典科研計(jì)劃；中國科學(xué)院重點(diǎn)部署項(xiàng)目 （KSZD-EW-Z-004）

楊 艷（1990—），女，碩士，研究方向?yàn)橹兴幓瘜W(xué)成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：154984840@qq.com

*通信作者：易進(jìn)海（1963—），男，研究員，研究方向?yàn)橹兴幓瘜W(xué)成分與質(zhì)量評(píng)價(jià)。Tel： （028）85210843，E-mail：yijinhai63@ 163.com

待測藥物以甲醇提取，HPLC分析采用的色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-水 （52∶48）。測定洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯的相對(duì)校正因子，考察其校正因子的重現(xiàn)性，并與外標(biāo)法進(jìn)行比較。結(jié)果都梁滴丸和血府逐瘀膠囊能同時(shí)檢測出洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯，而白帶丸僅檢測出藁本內(nèi)酯。在Agilent E-clipse XDB-C18、Phenomenex Luna C18和Agilent Zorbax SB-C18色譜柱上測定的相對(duì)校正因子重現(xiàn)性好，與外標(biāo)法實(shí)測值無顯著差異。結(jié)論本法可用于川芎、當(dāng)歸的質(zhì)量控制，解決了洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯對(duì)照品不穩(wěn)定的難題。