卞 華， 郝鵬飛， 呂 芹， 山書玲， 付衛(wèi)云， 張瓅方

（1.南陽理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南南陽473004；2.南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南南陽473061）

解毒活血滋陰方免疫抑制作用有效部位的篩選研究

卞 華1， 郝鵬飛1， 呂 芹2， 山書玲， 付衛(wèi)云1， 張瓅方1

（1.南陽理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南南陽473004；2.南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南南陽473061）

目的分離并篩選解毒活血滋陰方對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡免疫抑制作用的有效部位。方法制備解毒活血滋陰方水溶性部位、乙醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、乙醇部位的提取物。在體內(nèi)研究中，采用小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型和雞紅細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠血清溶血素生成模型，觀察解毒活血滋陰方不同提取部位對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫的影響；體外研究檢測解毒活血滋陰方不同提取部位對(duì)ConA及LPS誘導(dǎo)的小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位能夠明顯減輕小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠耳腫脹、降低小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，對(duì)雞紅細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠血清溶血素生成具有抑制作用。同時(shí)解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位各劑量組均可抑制T、B淋巴細(xì)胞增殖，且呈一定劑量依賴性。結(jié)論解毒活血滋陰方治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡免疫抑制作用的有效部位可能是水溶性部位和乙酸乙酯部位。

解毒活血滋陰方；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；有效部位；免疫抑制作用

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種原因未明，以多系統(tǒng)或器官病變和血清中出現(xiàn)多種自身抗體為特征的自身免疫性疾病。解毒活血滋陰方由白花蛇舌草、生地、赤芍、青蒿、山茱萸等中藥組成，具有解毒活血、滋陰清熱之功效，其治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡療效顯著，且具有較高的安全性［1-3］。但該方治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的主要藥效部位尚不清楚，傳統(tǒng)的水煎煮法導(dǎo)致一些水不溶性成分難免會(huì)流失。本研究以藥效評(píng)價(jià)為導(dǎo)向，通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)探討解毒活血滋陰方不同提取部位對(duì)細(xì)胞免疫、體液免疫功能和脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，篩選其免疫抑制作用的有效部位，闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)ICR小鼠，雌雄各半，18～22 g，6～8周齡，購自于中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK（滬）2012-0002。

1.2 藥物與試劑 解毒活血滋陰方所含藥物 （白花蛇舌草、生地、赤芍、青蒿、山茱萸等）由南陽理工學(xué)院附屬醫(yī)院提供，經(jīng)黃顯章副教授鑒定均符合 《中國藥典》2010年版標(biāo)準(zhǔn)；醋酸地塞米松片（Dexamethasone，Dex），天津天藥藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)110420；二硝基氟苯 （2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）、刀豆球蛋白A（ConA）、脂多糖 （LPS）、四甲基偶氮唑藍(lán) （MTT）均購于美國Sigma公司；胎牛血清（FCS）購于杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640、十二烷基磺酸鈉（SDS）購于美國Gibco公司。

1.3 主要儀器 Biocell 2010酶聯(lián)免疫檢測儀（奧地利Anthos公司）；Ti-S型研究級(jí)倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Thermo 8000型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；超凈工作臺(tái)（河南智誠科技發(fā)展有限公司）；Sartorius電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；冷凍干燥機(jī) （美國Labconco公司）。

2 方法

2.1 解毒活血滋陰方不同部位的制備 將全方藥材按照一定比例組合后混勻，以75%乙醇浸漬48 h，每12 h更換一次溶劑，過濾合并濾液備用；藥渣分別以8倍、6倍量水煎煮兩次合并濃縮后得水溶性部位；對(duì)藥渣再次分別以乙醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇進(jìn)行提取，得到乙醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；取乙醇浸出液，濃縮后凍干得干燥粉末，加入水混懸后分別以乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，依次分別得到乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液，分別與上述相應(yīng)提取液合并；而最終所剩即為乙醇部位。

2.2 遲發(fā)型超敏（DTH）反應(yīng)測定實(shí)驗(yàn) 取80只ICR小鼠，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分出10只作為空白對(duì)照組，其余小鼠參照相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法［4］建立DTH小鼠模型：實(shí)驗(yàn)開始第1天和第2天在小鼠腹部固定部位脫毛，面積約3 cm2，于去毛部位涂0.5%DNFB（以丙酮-橄欖油4∶1的比例配置）40μL致敏，第7天于左耳內(nèi)外側(cè)涂0.3%DNFB20μL激發(fā)。按體質(zhì)量隨機(jī)將造模小鼠分為7組：模型組、Dex組（1.5 mg/kg）、水溶性部位組（966 mg/kg）、乙醚部位組（59 mg/kg）、乙酸乙酯部位組（188 mg/kg）、正丁醇部位組（22 mg/kg）、乙醇部位組 （321 mg/kg）。自致敏前2 d開始，按上述劑量每日灌胃實(shí)驗(yàn)藥物0.2 mL/10 g，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組灌胃等量蒸餾水，1次/d，連續(xù)8 d。激發(fā)48 h后頸椎脫臼法處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器在相同部位取直徑8 mm耳片，以游標(biāo)卡尺測量厚度并以分析天平稱定質(zhì)量，同時(shí)取小鼠胸腺及脾臟稱定質(zhì)量。以左右耳片厚度、質(zhì)量之差為腫脹度；以每10 g小鼠的脾質(zhì)量和胸腺質(zhì)量作為脾指數(shù)和胸腺指數(shù)脾。脾 （胸腺）指數(shù)=［脾 （胸腺）質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）］×10。

2.3 血清溶血素測定［5］取70只ICR小鼠，按體質(zhì)量隨機(jī)分成7組：模型組、Dex組 （1.5 mg/kg）、水溶性部位組（966 mg/kg）、乙醚部位組（59 mg/kg）、乙酸乙酯部位組（188 mg/kg）、正丁醇部位組 （22 mg/kg）、乙醇部位組 （321 mg/kg）。按上述劑量每日灌胃實(shí)驗(yàn)藥物0.2 ML/ 10 g，模型組灌胃等量蒸餾水，1次/d，連續(xù)給藥9 d。各組小鼠在給藥的第3天腹腔注射5%的雞紅細(xì)胞生理鹽水混懸液0.2 mL進(jìn)行免疫。于免疫后第7天，末次給藥2 h后，小鼠眼球后靜脈采血制備血清，用生理鹽水1∶100稀釋后，取1 mL稀釋的血清與5%的雞紅細(xì)胞混懸液0.5mL、10%補(bǔ)體（豚鼠血清）0.5 mL混勻，在37℃恒溫箱中溫育30 min，在冰水中中止反應(yīng)，2 000 r/min離心10 min，取上清液加入 96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL，于540 nm處比色，另設(shè)不加血清的對(duì)照管，以空白管調(diào) “0”點(diǎn)，測各管的吸光度，以間接判斷血清中溶血素含有量。

2.4 脾細(xì)胞懸液的制備 將處死的小鼠放入75%乙醇中浸泡消毒1 min，無菌條件下取脾臟并去掉被膜，于200目篩網(wǎng)上輕捻脾組織，使細(xì)胞經(jīng)篩網(wǎng)過濾至離心管中，離心 （1 500 r/min，10 min）后棄上清。用紅細(xì)胞裂解液除去紅細(xì)胞，用PBS沖洗2～4次。最后加入10%FCS-RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)小鼠脾淋巴細(xì)胞為3×106個(gè)/ML備用。

2.5 T、B淋巴細(xì)胞增殖活性分析［6］分別檢測ConA刺激的T淋巴細(xì)胞增殖和LPS刺激的B淋巴細(xì)胞增殖。將上述脾細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL。實(shí)驗(yàn)分組如下：空白本底組 （只加RPMI-1640培養(yǎng)基），對(duì)照組 （加入終質(zhì)量濃度為5μg/mL的ConA或10μg/mL的LPS）、不同質(zhì)量濃度解毒活血滋陰方各部位提取物干預(yù)下的實(shí)驗(yàn)組（分別加入終質(zhì)量濃度為5、15、25、35μg/mL的各部位提取物）、Dex組 （加入Dex，終濃度同上），每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板于37℃，5% CO2溫箱中培養(yǎng)48 h。之后每孔分別加入10μL MTT溶液再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后加入100μL/孔酸化的SDS，震蕩3 min，溫箱培養(yǎng)3 h。室溫20℃用酶標(biāo)儀于波長490 nm處測吸光度 （A值），計(jì)算T、B淋巴細(xì)胞的抑制率。抑制率=［（對(duì)照組A均值-實(shí)驗(yàn)組A均值）/（對(duì)照組A均值-空白本底組A均值）］ ×100%。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 解毒活血滋陰方不同提取部位的得率 由公式計(jì)算解毒活血滋陰方各提取部位的得率：得率%=（干燥粉末質(zhì)量/全方藥材質(zhì)量）×100%。結(jié)果顯示：水溶性部位為6.23%，乙醚部位為0.38%，乙酸乙酯部位為1.21%，正丁醇部位為0.14%，乙醇部位為2.07%。

3.2 解毒活血滋陰方不同提取部位對(duì)DTH小鼠耳殼腫脹度的影響 與空白組比較，DTH模型組耳殼增重和耳殼增厚顯著增加 （P＜0.01）。與模型組比較，解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位組均能明顯抑制小鼠耳殼的腫脹 （P＜0.01）。見表1。

表1 解毒活血滋陰方不同提取部位對(duì)DTH小鼠耳殼腫脹度的影響 （x±s，n=10）Tab.1 Effects of different extract fractions of JDHXZYF on auricle swelling in DTH Mice（x±s，n=10）

3.3 解毒活血滋陰方不同提取部位對(duì)DTH小鼠脾和胸腺指數(shù)的影響 與空白對(duì)照組比較，DTH模型組脾和胸腺指數(shù)均明顯升高 （P＜0.01）。與模型組比較，解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位組均可明顯降低小鼠免疫器官的臟器指數(shù)（P＜0.05，P＜0.01），同時(shí)解毒活血滋陰方乙醇部位組亦能降低小鼠脾腺指數(shù) （P＜0.05）。見表2。

表2 解毒活血滋陰方不同提取部位對(duì)DTH小鼠脾和胸腺指數(shù)的影響 （x±s，n=10）Tab.2 Effects of different extract fractions of JDHXZYF on thymus index and sp leen index in DTH Mice（x ±s，n=10）

3.4 解毒活血滋陰方不同提取部位對(duì)雞紅細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠血清溶血素水平的影響 解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位組對(duì)雞紅細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠血清溶血素生成具有抑制作用，可減少小鼠血清中抗體的水平，與模型組比較差異具有顯著性（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 解毒活血滋陰方不同提取部位對(duì)雞紅細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠血清溶血素的影響 （x±s，n=10）Tab.3 Effects of different extract fractions of JDHXZYF on the level of hemolysin induced by fow l erythrocyte immunization in serum（x±s，n=10）

3.5 解毒活血滋陰方不同提取部位對(duì)小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響 如圖1、圖2所示，解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位各劑量組對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖和LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖呈現(xiàn)明顯的抑制作用，與同組低質(zhì)量濃度5μg/mL比較，15～35μg/mL抑制率差異有顯著性（P＜0.05，P＜0.01），其中質(zhì)量濃度達(dá)到15 μg/mL時(shí)，乙酸乙酯部位組對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)、水溶性部位組對(duì)B淋巴細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)甚至高于Dex陽性對(duì)照組 （P＜0.05）。同時(shí)，質(zhì)量濃度為25～35μg/ML乙醇部位組抑制率明顯高于低質(zhì)量濃度5μg/mL（P＜0.05）。

圖1 解毒活血滋陰方不同提取部位對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖的影響 （x±s，n=10）Fig.1 Effects of d ifferent extract fractions of JDHXZYF on ConA-induced T lyMphocyte proliferation（x±s，n=10）

圖2 解毒活血滋陰方不同提取部位對(duì)LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖的影響 （x±s，n=10）Fig.2 Effects of d ifferent extract fractions of JDHXZYF on LPS-induced B lymphocyte proliferation（x±s，n=10）

4 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡 （SLE）的發(fā)生與遺傳、環(huán)境、感染、性激素等有關(guān)，其大部分臨床表現(xiàn)都是由致病性抗體、免疫復(fù)合物和T細(xì)胞所致，免疫系統(tǒng)功能失調(diào)是SLE的主要發(fā)病機(jī)制［7-8］。目前臨床上常用的免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、糖皮質(zhì)激素等在治療SLE中發(fā)揮著重要作用，但這些藥物存在選擇性不強(qiáng)、毒副作用大等缺點(diǎn)［9］。因此，研究開發(fā)治療SLE的新型免疫抑制劑是目前亟待解決的問題。中藥解毒活血滋陰方是治療SLE的有效方劑，且具有較高的安全性。本研究將解毒活血滋陰方全方藥材分別采用有機(jī)性和水性溶劑進(jìn)行提取，并建立不同部位研究體系，以藥效學(xué)方法篩選其治療SLE的免疫抑制活性部位，為后續(xù)解毒活血滋陰方針對(duì)免疫活性調(diào)節(jié)的藥效理論、藥效機(jī)制研究及開發(fā)新藥奠定基礎(chǔ)。

DTH是由效應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)，以單個(gè)核細(xì)胞浸潤和組織細(xì)胞損傷為主要特征的炎癥反應(yīng)，與效應(yīng)T細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子或細(xì)胞毒性介質(zhì)有關(guān)，其反應(yīng)強(qiáng)弱與機(jī)體T細(xì)胞免疫功能相一致。DNFB所致小鼠DTH是典型的Ⅳ型超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，作為DTH模型被廣泛用于藥物評(píng)價(jià)研究［10］。本研究結(jié)果表明，解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位明顯減輕DTH模型小鼠耳腫脹度，提示解毒活血滋陰方能抑制效應(yīng)T細(xì)胞而減輕炎癥反應(yīng)。免疫器官 （胸腺、脾）不僅是淋巴細(xì)胞分化成熟的場所，也是產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的場所，其質(zhì)量升高或降低往往意味著機(jī)體淋巴細(xì)胞增殖的強(qiáng)弱，直接體現(xiàn)了免疫應(yīng)答功能。本研究表明，解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位明顯降低DTH模型小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，從而證實(shí)了解毒活血滋陰方能夠抑制小鼠體內(nèi)淋巴細(xì)胞增殖。在體外解毒活血滋陰方不同提取部位干預(yù)T淋巴細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位對(duì)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖呈現(xiàn)明顯的抑制作用，且乙酸乙酯部位高劑量（達(dá)到15μg/mL以上）抑制效應(yīng)甚至優(yōu)于Dex，呈一定劑量依賴性。上述結(jié)果提示解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位可干預(yù)淋巴細(xì)胞有絲分裂，抑制小鼠T淋巴細(xì)胞增殖，進(jìn)而下調(diào)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)揮免疫抑制作用。

B淋巴細(xì)胞受抗原——雞紅細(xì)胞刺激后，分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞產(chǎn)生一種抗體——溶血素，當(dāng)再次接受相同抗原刺激時(shí)，溶血素和抗原在補(bǔ)體的參與下發(fā)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，而紅細(xì)胞溶血與血清溶血素含量有關(guān)。因此，測定其上清液的吸光度，則可間接判斷血清中溶血素水平，從而反映雞紅細(xì)胞免疫后小鼠的特異性體液免疫。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位對(duì)雞紅細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠血清溶血素生成具有抑制作用，提示能夠抑制小鼠的體液免疫應(yīng)答。體外實(shí)驗(yàn)也證明不同劑量的解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位能夠明顯抑制B淋巴細(xì)胞增殖，且水溶性部位高劑量 （達(dá)到15μg/mL以上）的抑制效應(yīng)優(yōu)于Dex。這一結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相一致，說明解毒活血滋陰方水溶性部位、乙酸乙酯部位具有抑制體液免疫的功能。

解毒活血滋陰方由白花蛇舌草、蘇木、青蒿、山茱萸等藥物組成，該復(fù)方所含成分包括：黃酮類、苯丙素類、萜類、揮發(fā)油、鞣質(zhì)以及多種植物多糖、氨基酸等。現(xiàn)代藥理研究表明，白花蛇舌草能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，具有抑制免疫作用［11］；蘇木乙酸乙酯提取物能夠抑制淋巴細(xì)胞增殖，同時(shí)水提物能通過上調(diào)CD4+CD25+T細(xì)胞及Foxp3活性起到較強(qiáng)的免疫抑制作用［12-13］；青蒿素在體外明顯抑制刀豆蛋白A誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖，在體內(nèi)能夠減輕變應(yīng)性接觸性皮炎小鼠耳腫脹，降低小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡，抑制炎癥反應(yīng)和免疫功能［9，14］；山茱萸總苷通過抑制大鼠細(xì)胞免疫功能，抑制弗氏完全佐劑所致免疫性炎癥模型-大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎［15］。這些研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是相符的。

綜上所述，解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位能明顯抑制小鼠DTH反應(yīng)；抑制對(duì)雞紅細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠血清溶血素生成；抑制T、B淋巴細(xì)胞增殖，具有較好的免疫抑制活性，是其治療SLE的有效部位，但其調(diào)節(jié)免疫的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Screen of imMunosuppressive fractions froMJiedu Huoxue Ziyin Formula

BIAN Hua1， HAO Peng-fei1， LüQin2， SHAN Shu-ling1， FUWei-yun1， ZHANG Li-fang1

（1.Medical School of Nanyang Instituteof Technology，Nanyang 473004，China；2.Nanyang Medical College，Nanyang 473061，China）

AIMTo separate and screen immunosuppressive active fractions froMJiedu Huoxue Ziyin Formula（JDHXZYF）for systemic lupus erythematosus.METHODSDifferent extracts of JDHXZYF were prepared with water-soluble，ether-soluble，ethyl acetate，n-butanol，and ethanolic fractions.The in vivo cell and humoral immunity responses of JDHXZYF componentswere observed by delayed-type hypersensitivity（DTH）in mice and the production of specific hemolysin antibody against fowl erythrocyte.The effects of different extract fractions on ConA-induced or LPS-induced T lymphocyte and B lymphocyte proliferation were determined in in vitro tests.RESULTSThe water-soluble and the ethyl acetate fraction could alleviate auricle swelling in DTH mice and decrease the thymus and spleen index，and the seruMhemolysin level induced by fowl erythrocyte.Meanwhile，the watersoluble and the ethyl acetate fractions of JDHXZYF had obvious effects on the proliferation of T lymphocyte and B lymphocyte in a concentration-dependentmanner in vivo.CONCLUSIONThe water-soluble fraction and the ethyl acetate fraction can be identified as immunosuppressive active fractions of JDHXZYF for systemic lupus erythematosus.

Jiedu Huoxue Ziyin Formula（JDHXZYF）；systemic lupus erythematosus；active fraction；immunosuppressive action

R285.5

：A

：1001-1528（2015）05-0943-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.004

2014-09-01

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目 （102102310167）

卞 華 （1973—），男，副教授，博士，從事自身免疫性疾病的研究。Tel：（0377）62071311，E-mail：biancrown@163.com