祝雙華， 劉曉群， 姜懷德， 鄭超然， 詹宇婷， 梁尚棟， 李桂林*

（1.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西南昌330006；2.南昌大學(xué)撫州醫(yī)學(xué)院，江西撫州344000）

［藥理］

蛇床子素對高糖誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

祝雙華1， 劉曉群2， 姜懷德1， 鄭超然1， 詹宇婷1， 梁尚棟1， 李桂林1*

（1.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西南昌330006；2.南昌大學(xué)撫州醫(yī)學(xué)院，江西撫州344000）

目的研究蛇床子素對高糖誘導(dǎo)原代培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞 （HUVEC）炎癥的保護(hù)作用。方法將HUVEC細(xì)胞分為對照組、高糖組、對照+蛇床子素組和高糖+蛇床子素組。培養(yǎng)5 d后，采用硝酸還原酶法測定細(xì)胞上清液中一氧化氮（NO），熒光酶標(biāo)儀測定細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS），并通過real-time PCR和Western blot法檢測趨化因子CCL5及其受體CCR5mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果高糖明顯降低對照組細(xì)胞上清液中NO水平同時升高ROS，蛇床子素能增加高糖組細(xì)胞上清液中NO水平同時降低高糖組細(xì)胞內(nèi)ROS；real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示蛇床子素可以降低高糖組細(xì)胞CCL5及其受體CCR5 mRNA和蛋白的表達(dá)量。結(jié)論蛇床子素對高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害具有保護(hù)作用是與其抗氧化應(yīng)激及抗炎作用有關(guān)。

糖尿病；蛇床子素；CCL5；血管內(nèi)皮細(xì)胞；一氧化氮；活性氧

糖尿病是一種嚴(yán)重的代謝性疾病。它引起的心血管病變累及身體各臟器導(dǎo)致各種并發(fā)癥，其中最常見的是糖尿病心血管并發(fā)癥包括腎病、視網(wǎng)膜病、心腦血管病、神經(jīng)病變、下肢潰爛等，嚴(yán)重危害人們的健康［1-2］。在糖尿病心血管病變發(fā)病中，血管內(nèi)皮起著一個關(guān)鍵的作用，在高血糖癥狀出現(xiàn)前血管內(nèi)皮已發(fā)生功能異常［3-4］。前期的基因芯片分析發(fā)現(xiàn)慢性高糖可導(dǎo)致人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）趨化因子CCL5（CC類趨化因子配體5）明顯升高達(dá)15倍［5］。趨化因子通過與受體結(jié)合促進(jìn)機(jī)體各種炎癥性疾病以及各種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展［6］。然而，趨化因子在高糖條件下引發(fā)糖尿病內(nèi)皮功能損害的發(fā)病機(jī)理中的作用知之甚少。蛇床子素是從傘形科植物蛇床成熟果實(shí)蛇床子中提取的香豆素，具有抗炎、抗氧化、清除自由基、降血脂作用［7-9］，提示它對糖尿病的發(fā)病可產(chǎn)生影響，可能對糖尿病心血管并發(fā)癥產(chǎn)生治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料 MCDB-131，肝素，牛血清白蛋白，胰蛋白酶，Ⅰ型膠原酶，兔源性CCL5多克隆抗體，兔源性CCR5多克隆抗體，均購自Sigma公司。堿性成纖維生長因子購自Chemicon公司；胎牛血清購自Hyclone公司；蛇床子素（osthole，純度≥98%），購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司 （批號091010）；CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（MTS），購自Progrema公司；ROS檢測試劑盒，購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；NO試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；β-actin抗體（sc-47778）購自Santa Cruz公司；羊抗兔IgG-HRP，購自北京華美生物工程公司；ECL熒光底物（37071）購自Pierce公司；ABI7500熒光定量PCR儀（Appleid Biosystems公司）；UVVIS 2501PC紫外-可見分光光度計(jì) （日本島津公司）；熒光分光光度計(jì)（Tecan infinite M200，Tecan公司）。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC的原代分離培養(yǎng)和分組 健康產(chǎn)婦分娩后12 h內(nèi)的臍帶經(jīng)PBS反復(fù)沖洗，0.2%的膠原酶37℃水浴消化15 min，收集消化液，離心棄上清，用HUVEC培養(yǎng)液（MCDB-131，15%胎牛血清，17.7 U/mL肝素，2.5 g/mL青霉素，100 g/mL鏈霉素，20μg/mL酸性成纖維生長因子）重懸細(xì)胞，接種于經(jīng)0.1%明膠處理過的培養(yǎng)瓶內(nèi)，24 h后更換培養(yǎng)液，以后每2～3 d換液1次，細(xì)胞融合后傳代培養(yǎng)。第4代HUVEC隨機(jī)分成4組：①正常對照組即5.5 mmol/L葡萄糖、②高糖對照組即44.4 mmol/L的葡萄糖、③正常加蛇床子素組即5.5 mmol/L葡萄糖加100 nmol/L的蛇床子素、④高糖加蛇床子素組即44.4 mmol/L的葡萄糖加100 nmol/L的蛇床子素。

1.2.2 MTS法確定蛇床子素濃度 HUVEC按每孔5 000個細(xì)胞接種于 96孔培養(yǎng)板內(nèi)，5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24 h后每孔加入不同濃度的蛇床子素，培養(yǎng)5 d后換成無血清無酚紅培養(yǎng)液每孔100μL并加入MTS溶液20μL，培養(yǎng)2 h后將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀內(nèi)，測定490 nm波長處的吸光度（OD）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次不同濃度均設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO的測定 各組細(xì)胞培養(yǎng)5 d后取培養(yǎng)上清液用硝酸還原酶法測定培養(yǎng)液中NO的量，具體操作過程嚴(yán)格按照NO試劑盒檢測說明書進(jìn)行。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)ROS的測定 熒光探針DCFH-DA按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液釋稀至終濃度為10 μmol/L。6孔培養(yǎng)板內(nèi)的各組細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，培養(yǎng)液換成1 mL已稀釋的DCFH-DA培養(yǎng)液培養(yǎng)20 min后，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞以去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的熒光探針。收集并重懸細(xì)胞，熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長535 nm，測定各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.2.5 Real-time PCR檢測HUVEC CCL5和CCR5 mRNA的表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，采用TRIZOL法提取各組細(xì)胞總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green（TAKRA公司）法通過ABI7500 PCR儀對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果通過PCR儀自帶的7500 Software v 2.0.4軟件進(jìn)行分析，以βactin作為內(nèi)參。引物序列如下：

β-actin正向5＇-TTTTTTGGCTTGACTCAGGAT-3＇反向5＇-GGGAGACCAAAAGCCTTCAT-3＇

CCL5正向5＇-TCGCTGTCATCCTCATTGCT-3＇反向5＇-AGGCTGGTCTCGAACTCCTG-3＇

CCR5正向5＇-ACATCTACCTGCTCAACCTG-3＇反向5＇-CATTGTATTTCCAAAGTCCC-3＇

1.2.6 Western blot檢測HUVEC CCL5和CCR5蛋白的表達(dá) 收集各組HUVEC，去污細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，每組各取蛋白質(zhì)樣品（30μg）進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜封閉后加入一抗（兔源性CCL5和CCR5多克隆抗體均為1∶750）4℃過夜，羊抗兔IgG-HRP二抗反應(yīng)液 （稀釋比例為1∶5 000）室溫孵育1 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，放入成像系統(tǒng)（BIORAD）中拍照，得到蛋白條帶圖像。膜再生后用相同方法得到β-actin條帶，以β-actin為內(nèi)參，系統(tǒng)自帶軟件分析CCL5和CCR5的蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （x± s）表示，各組數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計(jì)采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素濃度的確定 HUVEC用不同濃度的蛇床子素處理5 d，細(xì)胞增殖狀況通過MTS方法檢測。結(jié)果顯示蛇床子素濃度在0到100 nmol/L之間時對細(xì)胞增殖無明顯影響；而蛇床子素濃度從1 000 nmol/L到10 000 nmol/L時可明顯減少細(xì)胞增殖 （P＜0.05）。故本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所用蛇床子素濃度為100 nmol/L（見圖1）。

圖1 蛇床子素對HUVECs增殖的影響Fig.1 E ffects of osthole on the proliferation of HUVECs

2.2 蛇床子素對細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO的影響

結(jié)果顯示在對照組、高糖組、對照加蛇床子素組和高糖加蛇床子素組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO濃度分別為（59.34±5.92）μmol/L、 （48.65±4.87）μmol/L、（58.11±5.81）μmol/L、（56.28±5.79）μmol/L。與對照組比較，高濃度葡萄糖能使細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO量顯著減少 （P＜0.05）；與高糖組比較，高糖加蛇床子素處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液的NO量明顯增加（P＜0.05）。正常對照組、正常加蛇床子素組與高糖加蛇床子素組之間細(xì)胞培養(yǎng)上清液的NO量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）（見圖2）。

2.3 蛇床子素對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 與對照組相比較，高濃度葡萄糖能使HUVEC內(nèi)ROS的生成顯著增加 （P＜0.05），對照加蛇床子素組和高糖加蛇床子素組無明顯變化 （P＞0.05）；與高糖組比較，高糖加蛇床子素組HUVEC細(xì)胞內(nèi)ROS的生成顯著減少（P＜0.05）（見圖3）。

圖2 蛇床子素對細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO的影響Fig.2 Effects of osthole on NO production inHUVECsmedia

圖3 蛇床子素對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響Fig.3 E ffects of osthole on ROS production in HUVECs

2.4 蛇床子素對HUVEC CCL5和CCR5 mRNA表達(dá)的影響 熒光定量PCR結(jié)果顯示高糖組CCL5 mRNA表達(dá)量較對照組明顯增加 （P＜0.01），高糖加蛇床子素組較高糖組降低 （P＜0.01）；高糖組CCR5 mRNA表達(dá)量較正常對照組增加（P＜0.05），高糖加蛇床子素組較高糖組降低 （P＜0.05）。HUVEC中CCL5和CCR5 mRNA的表達(dá)量在對照組、對照加蛇床子素組與高糖加蛇床子素組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（見圖4）。

2.5 蛇床子素對HUVEC CCL5和CCR5蛋白表達(dá)的影響 CCL5和CCR5蛋白印跡結(jié)果經(jīng)各組相應(yīng)β-actin標(biāo)化后顯示高糖對照組的CCL5和CCR5蛋白表達(dá)量均較對照組顯著增加 （P＜0.01），高糖加蛇床子素組CCL5和CCR5蛋白表達(dá)量較高糖組明顯下調(diào)（P＜0.01）。CCL5和CCR5蛋白的相對表達(dá)量在對照組、對照加蛇床子素組與高糖加蛇床子素組之間無顯著性差異 （P＞0.05）（見圖5）。

3 討論

糖尿病心血管病變是糖尿病最常見的并發(fā)癥，占2型糖尿病患者死亡的80%。內(nèi)皮功能障礙在包括炎癥，動脈粥樣硬化，血管生成等與糖尿病心血管疾病相關(guān)的病理過程中起著至關(guān)重要的作用。內(nèi)皮細(xì)胞所分泌的一氧化氮 （NO）可引起血管舒張，降低血管通透性，并抑制平滑肌細(xì)胞增殖。NO生物活性降低和/或生物合成減少是引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要原因［10］。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及功能紊亂與氧化應(yīng)激密切相關(guān)［11］。正常情況下機(jī)體內(nèi)活性氧 （ROS） （包括氧自由基、過氧化氫等）的產(chǎn)生和清除保持動態(tài)平衡，當(dāng)機(jī)體抗氧化能力下降時，ROS產(chǎn)生過多或清除過少，體內(nèi)ROS的水平顯著性升高將會導(dǎo)致氧化應(yīng)激性損傷。ROS可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。高糖血癥即 “糖毒性”在其中扮演了主要角色。

圖4 蛇床子素對HUVECs CCL5和CCR5 MRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effects of osthole on the expressions of CCL5 and CCR5 MRNA in HUVECs

圖5 蛇床子素對HUVECs CCL5和CCR5蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of osthole on the expressions of CCL5 andCCR5 protein in HUVECs

蛇床子素是從傘形科植物蛇床成熟果實(shí)蛇床子中提取的香豆素，具有抗高血壓、抗炎、抗心律失常、抗衰老、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松癥、抗變態(tài)反應(yīng)、促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶和增強(qiáng)免疫功能等作用［7-9］。高血糖導(dǎo)致血管細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧化基團(tuán)增加，導(dǎo)致一些關(guān)鍵蛋白質(zhì)和其他生物分子被氧化而使血管細(xì)胞功能受損，引發(fā)糖尿病心血管并發(fā)癥。由于蛇床子素有抗氧化、清除自由基、降血脂作用［7-9］，提示它對糖尿病的發(fā)病可產(chǎn)生影響，可能對糖尿病心血管并發(fā)癥產(chǎn)生治療作用。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示長期高糖狀態(tài)下的HUVEC與對照組比較趨化因子5（CCL5）mRNA表達(dá)量增加高達(dá) 15倍［5，12］。CCL5與內(nèi)皮細(xì)胞活性和內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)。高糖處理下的HUVEC基因表達(dá)模式的變化主要是氧化應(yīng)激增加誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷并激發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥［12］。

趨化因子（chemokines）是指由白細(xì)胞和某些組織細(xì)胞分泌的，對中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞具有趨化和激活作用的小分子細(xì)胞因子，是一個包括60多個分子質(zhì)量為8～10 kDa，參與免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)家族［13］。趨化因子配體5（CCL5），也稱為調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌活性的因子（RANTES），其受體為CCR5。CCL5調(diào)節(jié)多種炎癥反應(yīng)細(xì)胞穿過血管內(nèi)皮［14］。CCL5可以誘導(dǎo)并激活巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞在胰腺郎格罕小島的募集，并誘發(fā)巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放多種生物活性物質(zhì)，在胰島局部形成炎癥反應(yīng)，并進(jìn)一步損傷胰島β細(xì)胞的分泌功能，最終導(dǎo)致Ⅰ型糖尿病。胰島β細(xì)胞功能與胰腺組織CCL5的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與正常人相比2型糖尿病患者外周血CCL5濃度明顯升高，采用胰島素治療后患者外周血CCL5水平顯著降低［15-16］。炎癥與細(xì)胞因子水平增加及ROS的產(chǎn)生有關(guān)［17］。CCL5和CCR5的mRNA和蛋白表達(dá)增加可能與炎癥狀態(tài)下ROS生成增多有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示長期高濃度葡萄糖可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，同時觀察到HUVEC中CCL5和CCR5的mRNA和蛋白表達(dá)量較對照組均明顯增加，表明CCL5和CCR5可能參與了高糖引起的血管內(nèi)皮損傷的病理生理過程。

近年來的研究認(rèn)為2型糖尿病是一個慢性低度炎癥狀態(tài)，其發(fā)展是固有免疫反應(yīng)的急性加劇和/或累積的過程。2型糖尿病常伴有多種炎癥因子如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、纖溶酶原激活抑制物-1（PAI-1）濃度的升高，不但直接降低胰島素敏感性，參與胰島素抵抗，而且與糖尿病大血管并發(fā)癥的危險性聯(lián)系緊密［18］。臨床研究發(fā)現(xiàn)抗炎治療可使2型糖尿病患者血液TNF-α和HbA1c水平顯著下降，空腹胰島素水平降低，胰島素敏感性增強(qiáng)，提示抗炎治療可改善2型糖尿病患者糖代謝異常。細(xì)胞因子在血管病變、胰島素抵抗和炎癥中起重要作用［19］。胰島素抵抗可使血糖升高，氧化應(yīng)激增強(qiáng)可導(dǎo)致炎癥加劇，而作為細(xì)胞因子的趨化因子及其受體在此進(jìn)程中具有重要作用。研究表明2型糖尿病動脈粥樣硬化患者血清CCL5、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、C反應(yīng)蛋白（CRP）的濃度和外周血巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞表面CCR5的密度均較對照組明顯升高。給予胰島素治療后，血清中CCL5、IL-6、TNF-α、CRP水平顯著下降，細(xì)胞表面CCR5的表達(dá)量顯著減少。表明胰島素治療可能通過抑制炎癥過程而減輕糖尿病動脈粥樣硬化病變［16，20］。本實(shí)驗(yàn)觀察正常和慢性高糖狀態(tài)下HUVEC中CCL5和CCR5的mRNA和蛋白表達(dá)水平及蛇床子素對其表達(dá)的影響，real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示蛇床子素可以降低高糖組細(xì)胞CCL5及其受體CCR5 mRNA和蛋白的表達(dá)量。高糖組細(xì)胞上清液中NO濃度明顯降低，蛇床子素能明顯增加高糖組細(xì)胞上清液中NO濃度；高糖組細(xì)胞內(nèi)ROS明顯升高，蛇床子素可以降低高糖組細(xì)胞內(nèi)ROS。因此，蛇床子素可能通過影響CCL5和CCR5的表達(dá)、ROS的產(chǎn)生和NO的釋放抑制糖尿病的慢性炎癥過程，對高糖引發(fā)的血管內(nèi)皮損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

綜上所述，本研究表明蛇床子素對慢性高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用；蛇床子素保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞與其抗氧化應(yīng)激及抗炎作用有關(guān)。

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Effects of osthole on human uMbilical vein endothelial cells injury induced by high glucose

ZHU Shuang-hua1， LIU Xiao-qun2， JIANG Huai-de1， ZHENG Chao-ran1， ZHAN Yu-ting1，LIANG Shang-dong1， LIGui-lin1*
（1.Medical College of Nanchang University，Nanchang 330006，China；2.Fuzhou Medical College of Nanchang University，F(xiàn)uzhou 344000，China）

AIMTo study the protective effects of osthole on the inflammation of primary cultured human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）induced by high glucose，which provided the theoretical basis for the study of new anti-diabetes agents.METHODSHUVECs were divided into four groups：control，high glucose，control+osthole，and high glucose+osthole group.After being cultured 5 d，the nitric oxide（NO）level in supernatantwas detected by nitrate reductase；intracellular reactive oxygen species（ROS）was analyzed with fluorescence probe；the expressions of CCL5 and CCR5 were measured by the real-time PCR and Western blot.RESULTSHigh glucosemarkedly decreased NO level in the supernatant in the control group but increased its ROS. Osthole elevated NO level in the supernatantwhen used with the high glucose，as well as lessened its ROS level. The results of real-time PCR and Western blot showed that osthole could weaken the expressions of CCL5 and CCR5 mRNA，which were induced by high glucose.CONCLUSIONOsthole has protective effects on the injury of HUVEC induced by high glucose.ItsworkingmechanisMmightbe related to the prevention and control of diabetes angiopathies.

diabetes；osthole；CCL5；vascular endothelial cell；nitric oxide；reactive oxygen species

R285.5

：A

：1001-1528（2015）05-0929-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.001

2014-07-12

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （81360140，30660059，81200853）；江西省教育廳資助項(xiàng)目 （GJJ12072）

祝雙華 （1993—），男，研究方向?yàn)榕R床醫(yī)學(xué)。E-mail：1099801319@qq.com

*通信作者：李桂林 （1972—），女，博士，教授，研究方向?yàn)樾难苌砗退幚怼el：（0791）86360556，E-mail：li.guilin@163.com