張靜 黃麗林 張曉輝 鐘毅 何泰龍 袁立燕 黃懷球

孢子絲菌病是孢子絲菌復(fù)合體所致的深部真菌病，其發(fā)病機(jī)制與機(jī)體免疫狀況和孢子絲菌毒力有關(guān)［1］。不同類型和強(qiáng)度的免疫反應(yīng)導(dǎo)致疾病的不同流行病學(xué)分布和臨床特征，因此，研究機(jī)體對(duì)孢子絲菌直接的免疫反應(yīng)是明確孢子絲菌病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。孢子絲菌入侵時(shí)，機(jī)體通過早期免疫細(xì)胞膜表面的模式識(shí)別受體等各種免疫識(shí)別受體對(duì)其進(jìn)行識(shí)別及介導(dǎo)各種免疫應(yīng)答，但具體機(jī)制尚不明確。Toll樣（TLR）受體家族是眾多模式識(shí)別受體中重要的家族，已有研究表明，TLR4、TLR2參與了機(jī)體對(duì)孢子絲菌、白念珠菌、煙曲霉菌絲、馬爾尼菲青霉的免疫識(shí)別［2-4］。目前研究已證實(shí)，TLR2和TLR4參與機(jī)體對(duì)真菌的免疫識(shí)別，進(jìn)一步激活胞內(nèi)信號(hào)分子，產(chǎn)生ROS和相關(guān)炎癥細(xì)胞因子直接或間接參與真菌免疫清除。不同的真菌誘發(fā)的免疫反應(yīng)類型及強(qiáng)度不同引起機(jī)體的組織病理改變亦不同［5］。本研究通過建立孢子絲菌BALB/c小鼠皮膚感染模型，檢測(cè)其感染皮膚TLR2、TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)水平及部位，探討TLR通路在孢子絲菌感染中的意義。

資料和方法

一、資料

1.菌株來源：孢子絲菌CMCC（F）D1a株由中國微生物菌種保藏中心提供。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：60只雌性7～8周BALB/c小鼠由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，體重20～25 g，合格證號(hào)SCXK粵2004-0011。

3.主要試劑和儀器：沙堡弱培養(yǎng)基（日本和光純藥株式會(huì)社）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基（日本和光純藥株式會(huì)社），生理氯化鈉液（北京恒安制藥有限公司），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（立陶宛MBI Fermentas公司），濾膜（英國Whatman公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（美國ABI公司），超微量紫外可見光分光光度計(jì)（中國ThermoFisher scientific公司）。

二、方法

1.孢子絲菌分生孢子懸液制備：將孢子絲菌CMCC（F）D1a株（菌絲相）轉(zhuǎn)種至SDA斜面培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)活化7 d，然后轉(zhuǎn)種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)1周后有產(chǎn)孢。用槍頭將1 ml生理氯化鈉液注入長滿菌落的斜面，輕輕吹打，然后吸出至EP管。室溫下靜置20 min左右，待菌絲沉淀后，輕輕將上清液吸出至另一微量離心管。14 167×g離心5 min，去除上清液，加入2 ml生理氯化鈉液。顯微鏡下觀察，若有少量短菌絲可作為孢子計(jì)數(shù)，若短菌絲較多，可繼續(xù)使用濾膜（Whatman No.1）進(jìn)一步過濾。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整菌懸液至1×107cfu/ml。將已配置菌懸液稀釋后接種于PDA平板，驗(yàn)證菌懸液活力及濃度。

2.小鼠皮膚感染模型：將60只BALB/c小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組隨機(jī)分為6小組，即：接種前、接種后 6、12、24、48、96 h組，每小組5只小鼠，另設(shè)5只無處理空白對(duì)照組。在實(shí)驗(yàn)組，每只小鼠背部皮下注射0.1 ml濃度為1×107cfu/ml的孢子絲菌懸液，對(duì)照組則皮下注射生理氯化鈉液。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠均在處理后 6、12、24、48、96 h 處死并取其注射部位附近皮膚組織。HE染色和PAS染色后觀察感染過程，組織培養(yǎng)出孢子絲菌即認(rèn)為造模成功。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：獲取的皮膚組織用Trizol試劑根據(jù)說明書進(jìn)行總RNA提取，采用紫外分光光度計(jì)評(píng)估其完整性并估算其產(chǎn)量。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。按照說明書采用ABI PRISM7000實(shí)時(shí)PCR嵌合熒光法，對(duì)TLR2和TLR4 mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。實(shí)時(shí)PCR所用引物（表1）均由大連TaKaRa生物公司合成，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。

4.免疫組化分析：皮膚組織常規(guī)石蠟包埋，切片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，光鏡下觀察TLR2及TLR4的表達(dá)。染色結(jié)果判定：染色強(qiáng)度依次為0分（無色），1分（淡黃色），2分（棕黃色），3分（棕褐色）；染色范圍以染色陽性細(xì)胞所占百分比表示，＜25%、25%～50%、51%～75%、＞75%分別判定為0、1、2、3分；染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比的乘積為免疫組化的結(jié)果：0、1～2、3～4、6～9分別判定為無（-）、弱（+）、中等（++）、大量（+++）。

5.ELISA：各組小鼠留取的血液自然凝固20min，4℃885×g離心20 min，ELISA法檢測(cè)血清中促炎細(xì)胞因子IL-12、TNF-α含量，操作嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

三、統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料符合方差齊性采用t檢驗(yàn)，組間用方差分析，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠皮膚組織病理

皮下注射孢子絲菌分生孢子和生理氯化鈉液96 h后，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)肉眼可見皮損。但是切片HE染色顯示，實(shí)驗(yàn)組有炎癥細(xì)胞浸潤，PAS染色可見酵母相真菌，而在對(duì)照組未見炎癥細(xì)胞浸潤及酵母相真菌。見圖1。實(shí)驗(yàn)組皮膚組織可培養(yǎng)出孢子絲菌。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物

圖1 小鼠皮膚接種孢子絲菌分生孢子96 h后組織病理改變（×400） 1A、1C：對(duì)照組；1B、1D：實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組皮膚無異常改變，PAS染色陰性；實(shí)驗(yàn)組有明顯炎癥細(xì)胞浸潤，PAS染色可見酵母樣真菌（箭頭）

二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小鼠皮膚TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)水平

正常BALB/c小鼠低表達(dá)TLR2和TLR4 mRNA。實(shí)驗(yàn)組TLR2 mRNA在6 h內(nèi)升高，24 h達(dá)高峰（P＜0.05），隨后逐漸下降，到96 h其表達(dá)與正常組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)照組TLR2 mRNA表達(dá)在生理氯化鈉液處理后6 h內(nèi)升高（P＜0.05），隨后逐漸下降，在96 h與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組的TLR2 mRNA水平均高于對(duì)照組（P＜0.05，圖2）；TLR4 mRNA表達(dá)在孢子絲菌處理6 h內(nèi)達(dá)高峰，隨后逐漸降低。在對(duì)照組，TLR4 mRNA表達(dá)在6 h達(dá)高峰（P＜0.05），在其他時(shí)間點(diǎn)與正常小鼠相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，TLR2 mRNA水平在實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組（P＜0.05，圖3）。

三、免疫組化檢測(cè)小鼠皮膚TLR2和TLR4蛋白表達(dá)水平

圖2 孢子絲菌和生理氯化鈉液處理后不同時(shí)間小鼠皮膚TLR2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

正常小鼠皮膚不表達(dá)TLR2和TLR4蛋白（圖4、5）。對(duì)照組小鼠皮膚未見TLR2明顯表達(dá)，TLR4有弱表達(dá)。在孢子絲菌分生孢子組小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞膜上及細(xì)胞質(zhì)可見TLR2中等量表達(dá)，TLR4較強(qiáng)表達(dá)。TLR2、TLR4在對(duì)照組小鼠真皮部位未見明顯表達(dá)；在孢子絲菌分生孢子組小鼠真皮巨噬細(xì)胞膜上及細(xì)胞質(zhì)可見TLR2較強(qiáng)表達(dá)，TLR4中等量表達(dá)。

四、ELISA檢測(cè)血清中細(xì)胞因子IL-12、TNF-α含量

實(shí)驗(yàn)組血清中IL-12含量為29.25～31.17 ng/L，對(duì)照組為29.62～31.45 ng/L，兩組隨時(shí)間變化均無明顯升高趨勢(shì)，且各時(shí)間點(diǎn)兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組血清中TNF-α表達(dá)水平為272.80～300.06 ng/L，生理氯化鈉液處理組為271.06～288.04 ng/L，兩組隨時(shí)間變化均無明顯變化（P＞0.05），各時(shí)間點(diǎn)TNF-α的含量在兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

討 論

圖3 孢子絲菌和生理氯化鈉液處理后不同時(shí)間小鼠皮膚TLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

圖4 TLR2和TLR4在小鼠表皮的表達(dá)（免疫組化×400） 正常小鼠表皮TLR2、TLR4均未見明顯表達(dá)；生理氯化鈉液組小鼠表皮TLR2未見明顯表達(dá)，TLR4有弱表達(dá)；感染孢子絲菌分生孢子組小鼠皮膚TLR2在角質(zhì)形成細(xì)胞膜及胞質(zhì)中等量表達(dá)，TLR4大量表達(dá)

圖5 TLR2和TLR4在小鼠真皮的表達(dá)（免疫組化×400） 正常小鼠和生理氯化鈉液組小鼠真皮TLR2、TLR4均未見明顯表達(dá)；感染孢子絲菌分生孢子組小鼠真皮部位巨噬細(xì)胞膜上及細(xì)胞質(zhì)可見TLR2大量表達(dá)、TLR4中等量表達(dá)

孢子絲菌可通過皮膚傷口感染機(jī)體并激活皮膚早期免疫反應(yīng)系統(tǒng)，為了模仿人自然感染形成過程，通過皮下注射孢子絲菌分生孢子懸液建立動(dòng)物皮膚感染模型。本研究結(jié)果顯示，孢子絲菌可誘導(dǎo)小鼠皮膚TLR2和TLR4表達(dá)，提示TLR2和TLR4均參與了孢子絲菌的免疫識(shí)別。Sassa等［6］發(fā)現(xiàn)，感染孢子絲菌的TLR4基因缺陷小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在體外24 h后再次予孢子絲菌的脂類提取物刺激，結(jié)果促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、NO和抗炎癥細(xì)胞因子IL-10均表達(dá)下調(diào)，NF-κB轉(zhuǎn)位到核內(nèi)低于對(duì)照組。我們的研究也證實(shí)，孢子絲菌感染時(shí)，TLR4參與皮膚免疫識(shí)別，同時(shí)發(fā)現(xiàn)TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，提示與胞內(nèi)信號(hào)激活后細(xì)胞因子反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)組小鼠接種孢子絲菌后TLR2 mRNA皮膚表達(dá)在24 h達(dá)到高峰，TLR4 mRNA表達(dá)則在6 h達(dá)高峰，提示兩者在不同時(shí)間段發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，TLR4 mRNA表達(dá)水平高于TLR2 mRNA表達(dá)水平，提示在申克孢子絲菌早期免疫應(yīng)答中TLR4起更重要作用。TLR2通過誘導(dǎo)未成熟樹突細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟樹突細(xì)胞并分泌IL-12 發(fā)揮作用［7］。TLR2 缺陷 BALB/c小鼠中，TLR4能夠代償TLR2這一功能，TLR4誘導(dǎo)成熟樹突細(xì)胞分泌 IL-6 卻比 TLR2 更顯著［8］。Schauber等［9］發(fā)現(xiàn)，皮膚損傷可以通過維生素D依賴的機(jī)制促進(jìn)TLR2的表達(dá)，本研究對(duì)照組小鼠TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)在6 h后開始升高，與皮膚針刺損傷6 h后TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)有關(guān)，穿刺損傷引起的炎癥反應(yīng)輕微，以致TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)很快降至正常水平。

本研究發(fā)現(xiàn)，孢子絲菌誘導(dǎo)小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞TLR2和TLR4的表達(dá)，TLR2主要在表皮上層表達(dá)，TLR4 則在表皮全層表達(dá)。Pivarcsi等［10］發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)形成細(xì)胞可表達(dá)各種模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs），包括 TLR2 和 TLR4，微生物刺激角質(zhì)形成細(xì)胞時(shí)，TLR通路可介導(dǎo)NF-κB、NO和各種炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。促炎細(xì)胞因子IL-12和TNF-α是免疫系統(tǒng)激活的產(chǎn)物，其在孢子絲菌的免疫清除中發(fā)揮作用［11-12］。我們進(jìn)一步通過ELISA檢測(cè)TLR2和TLR4下游促炎細(xì)胞因子IL-12和TNF-α的分泌情況，發(fā)現(xiàn)與生理氯化鈉液對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組在各時(shí)間點(diǎn)的IL-12和TNF-α含量變化均不明顯，兩組間比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這可能是機(jī)體處于早期免疫反應(yīng)階段，主要以局部的免疫細(xì)胞反應(yīng)為主，尚未形成系統(tǒng)性免疫反應(yīng)，故血液中的細(xì)胞因子釋放量較少，反應(yīng)不出與對(duì)照組之間的差異。

孢子絲菌接種后真皮巨噬細(xì)胞可表達(dá)TLR2和TLR4。巨噬細(xì)胞通過吞噬和殺傷孢子發(fā)揮抗真菌感染第一道防線，TLR可介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的吞噬功能［13］。TLR2 介導(dǎo)巨噬細(xì)胞對(duì)煙曲霉的識(shí)別和吞噬［14］，TLR4在巨噬細(xì)胞防御真菌中的重要作用［6］，本研究也證實(shí)皮膚巨噬細(xì)胞TLR4和TLR2的表達(dá)在真菌感染防御中起作用。可見，孢子絲菌感染時(shí)，小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共同表達(dá)TLR2和TLR4，發(fā)揮抗真菌免疫作用。

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