朱 媛，張雪松，黃小忠

1 南京曉莊學(xué)院，南京 210017;2 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，句容 212400

自由基是機(jī)體氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，具有強(qiáng)氧化性，可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞，進(jìn)而引起慢性疾病及衰老效應(yīng)。而DPPH 自由基在實(shí)驗(yàn)室研究中用于抗氧化成分的體外抗氧化性評(píng)價(jià)。由于化學(xué)合成的抗氧化劑存在致癌、毒副作用等安全問(wèn)題因而，天然抗氧化劑是減輕細(xì)胞氧化損傷、預(yù)防相關(guān)疾病和延緩衰老的最有效措施［1］。茶多酚是一種從茶葉中提取的天然抗氧化劑，已經(jīng)得到許多領(lǐng)域的應(yīng)用。兒茶素類是茶多酚的主要功能物質(zhì)，此類物質(zhì)脂溶性較差，如果直接添加到油相中，會(huì)出現(xiàn)凝聚和沉淀現(xiàn)象，會(huì)降低茶多酚的抗氧化性能［2，3］。

目前，分子修飾是國(guó)內(nèi)外改造物質(zhì)性質(zhì)的重要途徑，是改變物質(zhì)生物學(xué)活性的重要手段。一般常用的改性方法有溶劑法、乳化法、分子修飾法等［4-7］。通過(guò)茶多酚改性，一方面可以提高物質(zhì)的原有特性使其作用效果更高更好，另一方面通過(guò)引入各種功能集團(tuán)而賦予其新的生理活性，從而擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。本文以乙酸酐為?；瘎?，對(duì)茶多酚進(jìn)行乙?；男匝芯?。利用響應(yīng)面分析法，以衡量產(chǎn)物抗氧化能力的DPPH(1，1-二苯基苦基苯肼)自由基抑制率為參數(shù)，優(yōu)化茶多酚乙?；に嚄l件。

1 材料與儀器

1.1 材料

大豆油:起始過(guò)氧化物值(POV)為3.04 mmol/kg。

1.2 儀器與試劑

RE-5203 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮)，WFG7200 分光光度計(jì)(上海尤尼柯)，DZG-6050SA 真空干燥箱(上海森信)，KQ3200E 超聲波振蕩儀(昆山超聲儀器有限公司)。茶多酚(＞98%，上海惠誠(chéng))，乙酸酐、乙酸乙酯(AR，江蘇強(qiáng)盛)、吡啶、氯仿(AR，上海凌峰)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 茶多酚乙酰化合成工藝及精制

乙酸酐為?；瘎?，乙酸乙酯為溶劑、吡啶為催化劑，回流加熱。反應(yīng)結(jié)束后，用少量水洗滌，靜止分層，取乙酸乙酯層，經(jīng)減壓蒸餾、真空干燥后獲得產(chǎn)品。

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

依次改變?cè)弦毫媳?、吡啶用量、反?yīng)時(shí)間及反應(yīng)溫度四個(gè)因素，測(cè)定乙?；a(chǎn)物的DPPH 自由基抑制率值。

2.1.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert V8.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平如表1 所示。液料比、催化劑吡啶用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間分別對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)中因素的A、B、C、D，DPPH 自由基抑制率為衡量指標(biāo)。

表1 茶多酚乙?；憫?yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor level of acetylated tea polyphenols

2.2 DPPH 自由基抑制率測(cè)定［8］

將待測(cè)樣品用無(wú)水乙醇配置成1 g/L，再用乙醇稀釋成一定濃度，作為待測(cè)定樣品溶液。

測(cè)定:樣品溶液+DPPH 溶液各2 mL 為Ai(為樣品抑制吸收值);樣品溶液+無(wú)水乙醇2 mL 為Ac(為樣品對(duì)照);DPPH 溶液+無(wú)水乙醇各2 mL 為Aj(為無(wú)抑制吸收值);4 mL 無(wú)水乙醇為無(wú)抑制吸收值對(duì)照。分別充分振蕩混勻，室溫靜止30 min 后在517 nm 處測(cè)定吸收值(每個(gè)測(cè)定設(shè)兩個(gè)重復(fù))。DPPH 自由基抑制率按以下公式計(jì)算:抑制率=(Aj-Ai)/Aj。

2.3 產(chǎn)物脂溶性的測(cè)定

稱取10 mg 干燥后的產(chǎn)品，溶于10 mL 氯仿中，超聲10 min 使其溶解，配成濃度為1g/L 的溶液或懸液，震蕩器上震蕩混勻后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液或懸液800 nm 下的透光率。

2.4 油脂抗氧化測(cè)定

按GB/T5538-2005/ISO3960-2001 進(jìn)行油脂過(guò)氧化值(POV)測(cè)定，將樣品按GB2760-2007《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》的最大允許量溶于無(wú)抗氧化劑大豆油中，在63 ℃下每隔24h 測(cè)定POV 值，測(cè)定樣品抗氧化值［8］。按食用油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，油脂中POV 達(dá)到11.8mmol/kg 時(shí)所需時(shí)間為誘導(dǎo)時(shí)間，即活性氧法(active oxygen method，AOM)值，計(jì)算保護(hù)系數(shù)(PF):PF=添加抗氧化劑的AOM 值/未添加抗氧化劑的AOM 值。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

料液比(A)、吡啶用量(B)、反應(yīng)時(shí)間(C)及反應(yīng)溫度(D)對(duì)產(chǎn)物DPPH 自由基抑制率的影響見(jiàn)圖1(A～D)。由圖可知，經(jīng)過(guò)改性之后的產(chǎn)物DPPH自由基抑制率優(yōu)于未改性的茶多酚。隨著料液比、吡啶用量、反應(yīng)時(shí)間以及反應(yīng)溫度的增加，反應(yīng)產(chǎn)物DPPH 自由基抑制率均先升高后降低。當(dāng)料液比、吡啶用量、反應(yīng)時(shí)間以及反應(yīng)溫度分別為1∶8，0.3 g，2 h 以及60 ℃時(shí)，DPPH 自由基抑制率達(dá)到最大。

3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化茶多酚乙?；に嚄l件

3.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

茶多酚乙酰化響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 料液比(A)、吡啶用量(B)、反應(yīng)時(shí)間(C)及反應(yīng)溫度(D)對(duì)產(chǎn)物DPPH 自由基抑制率的影響Fig.1 Effects of solid-to-liquid ratio(A)，pyridine dosage(B)，reaction time(C)and temperature(D)on DPPH free radical scavenging rates of the synthesized compound

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Response surface experimental results of acetylated tea polyphenols

3.2.2 方差分析

對(duì)表2 數(shù)據(jù)運(yùn)用Design-Expert V8.0 軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

表3 模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

P＜0.05，說(shuō)明對(duì)應(yīng)的因素對(duì)響應(yīng)值影響顯著。從方差分析來(lái)看由于所選擇模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著，即所選擇的模型可靠。在液料比、吡啶用量、反應(yīng)時(shí)間以及溫度四個(gè)因素中，液料比、吡啶用量和反應(yīng)溫度的影響顯著。此外，四個(gè)因素對(duì)改性產(chǎn)物DPPH 自由基抑制率的影響也不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，諸因素之間的交互影響也較為顯著。

表4 R2 綜合分析表Table 4 Analysis of R2

從表4 可以看出，模型的R2=0.9960，R2校正=0.9921，R2預(yù)測(cè)與R2校正較為接近，信躁比為48.586(＞4)可知回歸方程擬合度和可信度均很高，試驗(yàn)誤差較小，故可用此模型對(duì)乙?；瓒喾拥墓に嚄l件進(jìn)行優(yōu)化與預(yù)測(cè)。

利用Design Expert V8.0 軟件對(duì)表2 所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，獲得微波提取茶多酚的多元二次回歸方程模型:DPPH 自由基抑制率=-7.97363+0.22601×A+6.57248×B-0.067910×C+0.22731×D+0.18100×A×B+0.068050×A×C+3.58375E-003×A×D-0.50650×B×C+0.068400×B×D+9.11500E-003×C×D-0.038633×A2-17.65817×B2-0.22108×C2-2.41669E-003×D2。

3.2.3 響應(yīng)曲面圖及其等高線圖

根據(jù)回歸方程，獲得響應(yīng)曲面圖及等高線圖，考察液料比、吡啶用量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度以及交互作用對(duì)DPPH 自由基抑制率的影響，如圖2～7 所示。

3.2.3.1 液料比和吡啶用量對(duì)DPPH 自由基抑制率的交互影響

圖2 為吡啶用量和液料比對(duì)改性產(chǎn)物DPPH 自由基抑制率的響應(yīng)曲面和等高線圖。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間與溫度為最佳值時(shí)，隨著吡啶用量以及液料比的增加，產(chǎn)物的DPPH 自由基抑制率均出現(xiàn)顯著的變化，抑制能力先增大后減小。由圖2 可以確定最佳水平范圍吡啶用量0.27～0.36 g，料液比為1∶7.3～1∶9.1。

圖2 液料比和吡啶用量對(duì)DPPH 自由基抑制率響應(yīng)曲面圖(A)與等高線圖(B)Fig.2 Response surface plot(A)and contour plot(B)showing mutual influences of liquid-to-solid ratio and pyridine dosage on DPPH·scavenging rates of the synthesized compound

3.2.3.2 時(shí)間和液料比對(duì)DPPH 自由基抑制率的交互影響

圖3 為時(shí)間和液料比對(duì)改性產(chǎn)物DPPH 自由基抑制率的響應(yīng)曲面和等高線圖。當(dāng)溫度與吡啶用量為最佳值時(shí)，隨著時(shí)間及液料比的增加，改性產(chǎn)物對(duì)DPPH 自由基抑制率均呈現(xiàn)出先增大后減小的現(xiàn)象。由圖3 可以確定最佳水平范圍時(shí)間為1.58～2.38 h，液料比為7.23～9.08。

圖3 時(shí)間和液料比對(duì)DPPH 自由基抑制率響應(yīng)曲面圖(A)與等高線圖(B)Fig.3 T Response surface plot(A)and contour plot(B)showing mutual influences of reaction time and liquid-to-solid ratio on DPPH·scavenging rates of the synthesized compound

3.2.3.3 溫度和液料比對(duì)DPPH 自由基抑制率的交互影響

圖4 為溫度和液料比對(duì)DPPH 自由基抑制率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖。當(dāng)時(shí)間與催化劑用量為最佳值時(shí)，隨著溫度和液料比的增加，改性產(chǎn)物的DPPH 自由基抑制率均先增大后減小。由圖4 可以確定最佳水平范圍溫度為52～65 ℃，液料比為7.3～9.1。

圖4 溫度和液料比對(duì)DPPH 自由基抑制率響應(yīng)曲面圖(A)與等高線圖(B)Fig.4 Response surface plot(A)and contour plot(B)showing mutual influences of reaction temperature and liquid-to-solid ratio on DPPH·scavenging rates of the synthesized compound

3.2.3.4 時(shí)間和吡啶用量對(duì)DPPH 自由基抑制率的交互影響

圖5 為時(shí)間和吡啶用量對(duì)改性產(chǎn)物DPPH 自由基抑制率的響應(yīng)曲面和等高線圖。當(dāng)溫度與液料比為最佳值時(shí)，隨著吡啶用量的變化，改性產(chǎn)物DPPH自由基抑制率先增大后減小。而當(dāng)時(shí)間改變時(shí)，產(chǎn)物的DPPH 自由基抑制率同樣是先增大后減小，但變化相對(duì)不是很顯著。由圖5 可以確定最佳水平范圍時(shí)間為1.58～2.34 h，催化劑用量為0.27～0.36 g。

圖5 時(shí)間和吡啶用量對(duì)DPPH 自由基抑制率響應(yīng)曲面圖(A)與等高線圖(B)Fig.5 Response surface plot(A)and contour plot(B)showing mutual influences of reaction time and pyridine dosage on DPPH·scavenging rates of the synthesized compound

3.2.3.5 吡啶用量與溫度對(duì)DPPH 自由基抑制率的交互影響

圖6 為吡啶用量和溫度對(duì)改性產(chǎn)物DPPH 自由基抑制率的響應(yīng)曲面和等高線圖。當(dāng)時(shí)間與液料比為最佳值時(shí)，隨著吡啶用量以及溫度的增加，改性產(chǎn)物DPPH 自由基抑制率均先增大后減小。由圖6 可以確定最佳水平范圍溫度為57.5～65 ℃，催化劑用量為0.27～0.36 g。

3.2.3.6 溫度和時(shí)間對(duì)DPPH 自由基抑制率的交互影響

圖7 為時(shí)間和溫度對(duì)DPPH 自由基抑制率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖。當(dāng)吡啶用量與液料比為最佳值時(shí)，隨著溫度的升高、時(shí)間的延長(zhǎng)，改性產(chǎn)物DPPH 自由基抑制率均先變大后減少。由圖可以確定最佳水平范圍溫度為57.5～64.8 ℃，時(shí)間為1.62～2.37 h。

圖6 吡啶用量和溫度對(duì)DPPH 自由基抑制率響應(yīng)曲面圖(A)與等高線圖(B)Fig.6 Response surface plot(A)and contour plot(B)showing mutual influences of pyridine dosage and reaction temperature on DPPH·scavenging rates of the synthesized compound

圖7 溫度和時(shí)間對(duì)DPPH 自由基抑制率響應(yīng)曲面圖(A)與等高線圖(B)Fig.7 Response surface plot(A)and contour plot(B)showing mutual influences of reaction temperature and time on DPPH·scavenging rates of the synthesized compound

3.2.4 最優(yōu)條件及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析可得模型理論最佳條件為液料比8.31、催化劑用量0.32 g、在61.5 ℃下回流反應(yīng)2.03 h，模型預(yù)測(cè)改性茶多酚DPPH 自由基抑制率為0.9376。按最優(yōu)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，所得改性茶多酚DPPH 自由基抑制率為0.9318，相對(duì)誤差為-0.64%，說(shuō)明此模型預(yù)測(cè)可靠。

3.3 茶多酚乙酰化性能比較

圖8 改性茶多酚與幾種抗氧化劑性能比較Fig.8 Comparison of DPPH·scavenging rates，fat protection index and light transmittance among modified tea polyphenol and other antioxidants

丁基羥基茴香醚(BHA)與特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)是兩種常見(jiàn)的抗氧化劑。茶多酚乙?；男援a(chǎn)物與這兩種常見(jiàn)抗氧化劑性能比較見(jiàn)圖8。從圖中可以看出，與未改性茶多酚相比，改性茶多酚的抗氧化能力得到了較大的提高。DPPH 自由基清除率從0.1220 提高到0.9318，比改性前提高了7.64倍;脂溶性也大大提高，透光率從0.225 提高到0.926，溶解性比改性前提高了4.12 倍;而衡量油脂抗氧化能力的保護(hù)系數(shù)從2.300 提高到6.612，提高了2.87 倍。乙?；蟮母男圆瓒喾涌寡趸芰?yōu)于BHA 以及TBHQ 這兩種常見(jiàn)抗氧化劑，DPPH 自由基清除率是特丁基對(duì)苯二酚的1.1 倍，保護(hù)系數(shù)是特丁基對(duì)苯二酚的2.48 倍。

4 結(jié)論

本文采用乙酸酐對(duì)茶多酚進(jìn)行改性，從四個(gè)因素(液料比、吡啶用量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度)考察了改性產(chǎn)品對(duì)DPPH 自由基抑制率的影響。利用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，建立了四因素相互作用的回歸模型，預(yù)測(cè)最佳乙酰化條件為料液比1∶8.31、催化劑用量0.32 g、反應(yīng)溫度61.5 ℃、反應(yīng)時(shí)間2.03 h，實(shí)驗(yàn)所得改性茶多酚DPPH 自由基抑制率為0.9318，與模型預(yù)測(cè)值非常接近，比改性前提高了7.64 倍。此條件下產(chǎn)物脂溶性良好，透光率為0.926，與未改性產(chǎn)品相比，溶解性提高了4.12 倍?？寡趸阅軐?shí)驗(yàn)顯示改性產(chǎn)物的抗氧化能力優(yōu)于BHA 和TBHQ 這兩種常見(jiàn)抗氧化劑。

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