晏 容，劉 云，朱欣婷，易小飛，劉 流，張云輝，李曉飛*

1 遵義醫(yī)學院基礎醫(yī)學院;2 遵義醫(yī)學院醫(yī)學與生物學研究中心，遵義 563003;3 貴州柏強制藥有限公司，貴陽 550001

斑蝥素是一種來源于抗癌昆蟲——斑蝥的抗腫瘤活性物質，對原發(fā)性肝癌、腹水型肝癌等具有良好治療效果［1］，但由于其水溶性差，造成在使用上的諸多不便。目前，國內已有研究者制備出水溶性較好的斑蝥酸鈉，并將其開發(fā)為注射液廣泛應用于臨床治療(如:貴州柏強制藥有限公司開發(fā)的《斑蝥酸鈉維生素B6 注射液》)。本課題組在此基礎上，以斑蝥素為原料研制出一種水溶性和體外抗癌活性都較好的斑蝥素鹽類衍生物——斑蝥素酸鎂［2，3］。為了進一步明確該化合物的體內抗癌活性，課題組構建了人肝癌細胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤模型，并對斑蝥素酸鎂的體內抑癌機制進行了初步研究，以期為下一步開發(fā)打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 藥物

斑蝥素酸鎂由自制斑蝥素合成而來，已授權國家發(fā)明專利［4］。

1.1.2 肝癌細胞株

人肝癌細胞SMMC-7721 購自中國科學院細胞庫。

1.1.3 實驗動物

BALB/C 裸鼠，4 周齡，體重15～17 g，雄性，購于重慶騰鑫生物技術有限公司，許可證號:SCXK(京)2009-0004;在遵義醫(yī)學院實驗動物中心SPF 級條件下飼養(yǎng)，動物實驗室合格證號:SYXK(黔)2011-003。

1.1.4 試劑

RPMI-1640 培養(yǎng)基購自美國GIBCO 公司;南美胎牛血清、胰蛋白酶購自美國HYCLONE 公司;鼠抗人AFP 單克隆抗體、SP 免疫組化試劑盒、PV6001 二步法免疫組化檢測試劑盒及鼠抗人bcl-2、bax 單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.5 儀器

3131 型CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo 公司;超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司;倒置顯微鏡，日本Nikon 公司;NikonYS100 光學顯微鏡，日本Nikon 公司;H-7550 型透射電鏡，日本Hitachi 公司;JEM-1400 型透射電鏡，日本電子公司;細胞圖像分析系統(tǒng)，德國Leica 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肝癌細胞的培養(yǎng)

人肝癌細胞SMMC-7721 采用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 人肝癌細胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤模型的建立

取對數(shù)生長期的人肝癌細胞SMMC-7721，PBS洗兩次，用0.25%胰酶消化，1000 rpm 離心5 min，收集細胞，鏡下計數(shù)。生理鹽水調整細胞密度為1×107/mL，每只取0.2 mL 接種于裸鼠腋窩皮下，接種后每日觀察裸鼠成瘤情況。隨機挑取已成瘤的裸鼠三只，頸椎脫位法處死裸鼠，取移植瘤標本。置于10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE 染色后用光鏡觀察移植瘤組織病理學變化。同時按照SP 試劑盒說明書進行免疫組化染色。陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。AFP 染色的陽性判斷:腫瘤細胞胞漿出現(xiàn)黃色或棕黃色物質。最后結合移植瘤組織病理學變化和AFP 染色結果確定人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型是否成功建立。

1.2.3 實驗動物分組及處理

實驗隨機分為兩組，分別為生理鹽水組(n=5)、斑蝥素酸鎂組(n=5)。待移植瘤體積大小約150～250 mm3開始用藥，以每只裸鼠6.26×10-5mmol 劑量的斑蝥素酸鎂進行瘤周注射，對照組給予相同容積的無菌生理鹽水瘤周注射，注射隔日一次，共計11 次;22 d 后，觀察裸鼠皮下移植瘤生長情況，并取出實體瘤作后續(xù)研究。

1.2.4 人肝癌裸鼠皮下移植瘤組織形態(tài)特征的觀察

取斑蝥素酸鎂組、生理鹽水組移植瘤標本，置于10%福爾馬林中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE 染色，光鏡下觀察移植瘤的組織形態(tài)特征。

1.2.5 透射電鏡觀察人肝癌裸鼠皮下移植瘤組織超微結構

移植瘤標本置于3.5%戊二醛進行前固定;PBS沖洗后用1%鋨酸后固定2 h;常規(guī)梯度丙酮脫水;梯度Epon812 包埋劑浸透，純包埋劑包埋并聚合;超薄切片;染色;透射電子顯微鏡下觀察。

1.2.6 免疫組化法檢測人肝癌裸鼠皮下移植瘤組織中bcl-2、bax 的表達

將瘤體于10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。按照PV6001 二步法免疫組化檢測試劑盒說明進行操作。陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。將切片置于光鏡下觀察，細胞質和細胞膜染成棕黃色或棕褐色的即為bcl-2、bax 陽性細胞。采用Image-Pro Plus 圖像分析軟件對bcl-2、bax 的表達進行定量分析(每張切片隨機選取5 個高倍鏡視野，測量每個視野下陽性細胞的平均光密度值)。

1.2.7 統(tǒng)計學分析

數(shù)據用SPSS 13.0 軟件包進行單因素方差分析，P＜0.05 表示有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 人肝癌細胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤模型的建立

裸鼠皮下移植瘤模型是常用的一種腫瘤實驗研究模型，具有方法簡便、成瘤率高、易于觀察、測量等優(yōu)點［5］，因而在腫瘤研究中得了廣泛應用。本試驗將人肝癌細胞SMMC-7721 接種于裸鼠皮下以觀察腫瘤生長情況。結果顯示:平均8～10 d 裸鼠腋窩皮下接種處出現(xiàn)瘤塊，成瘤率100%，隨著飼養(yǎng)時間的延長，瘤塊逐漸增大(圖1)，無自發(fā)消退現(xiàn)象。HE 染色，在光學顯微鏡下可見，腫瘤細胞呈大小不等實性、巢團狀分布，未見明確壞死灶，間質纖維組織增生、玻變(圖2)。AFP 染色呈陽性即腫瘤細胞胞漿可見棕黃色物質(圖3)。HE 染色、AFP 染色證實為肝細胞性肝癌組織，表明裸鼠皮下移植瘤模型建立成功。

圖1 裸鼠成瘤Fig.1 Tumor formation in nude mice

圖2 移植瘤組織HE 染色(×100)Fig.2 HE staining of transplantation tumor tissue(×100)

圖3 移植瘤組織AFP 染色(×400)Fig.3 AFP staining of transplantation tumor tissue(×400)

2.2 斑蝥素酸鎂對人肝癌裸鼠皮下移植瘤增殖和組織形態(tài)的影響

圖4 斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤增殖的影響Fig.4 The effects of magnesium cantharidate on the proliferation of subcutaneous transplantation tumor from human hepatoma cells SMMC-7721 in nude mice

圖5 斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤組織形態(tài)的影響(HE 染色×400)Fig.5 The effects of magnesium cantharidate on the histomorphology of subcutaneous transplantation tumor from human hepatoma cells SMMC-7721 in nude mice(HE staining×400)

斑蝥素酸鎂處理22 d 后，與生理鹽水對照組比較，斑蝥素酸鎂處理組皮下移植瘤的體積明顯小于對照組(圖4)，可見斑蝥素酸鎂對皮下移植瘤增殖有較強的抑制作用。在此基礎上，可以利用組織形態(tài)學方法進一步檢測其細胞凋亡情況。從圖5A 中可以看出，生理鹽水組:裸鼠移植瘤細胞排列呈條索狀、厚度約3～8 層，條索間可見裂隙狀血竇，腫瘤細胞呈圓形、多邊形，胞漿豐富、紅染，細胞核大、深染，可見病理性核分裂。斑蝥素酸鎂組:癌細胞胞漿固縮、嗜酸性變。細胞核固縮、碎裂(圖5B)。

2.3 斑蝥素酸鎂對人肝癌裸鼠皮下移植瘤組織超微結構的影響

在HE 染色法的基礎上進一步結合透射電鏡進行觀察，透射電鏡是最經典可靠的判定細胞凋亡的方法，被認為是鑒定細胞凋亡的金標準。鏡下見生理鹽水組移植瘤細胞表面有細小突起，核質比正常，核膜核仁清晰，粗面內質網、線粒體清晰可見(圖6A)。斑蝥素酸鎂組移植瘤細胞核膜基本消失，染色質聚集成團，細胞質均質，細胞器基本消失(圖6B)。形態(tài)學檢測表明斑蝥素酸鎂在裸鼠體內可誘導肝癌細胞凋亡。

圖6 斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤組織超微結構的影響Fig.6 The effects of magnesium cantharidate on the ultrastructure of subcutaneous transplantation tumor from human hepatoma cells SMMC-7721 in nude mice

2.4 斑蝥素酸鎂對人肝癌裸鼠皮下移植瘤組織中bcl-2、bax 表達的影響

2.4.1 染色觀察

光鏡下觀察細胞質和細胞膜染成棕黃色或棕褐色的即為bcl-2、bax 陽性細胞。從圖7A、7B 可見，斑蝥素酸鎂組瘤組織中bcl-2 陽性細胞數(shù)量與著色強度低于生理鹽水組。從圖7C、圖7D 可見，斑蝥素酸鎂組瘤組織中bax 陽性細胞數(shù)量與著色強度高于生理鹽水組。

2.4.2 圖像分析平均光密度值測定

斑蝥素酸鎂組瘤組織中bcl-2 陽性細胞的平均光密度值(0.172±0.024)，顯著低于生理鹽水組(0.318±0.063)(P＜0.05)。斑蝥素酸鎂組瘤組織中bax 陽性細胞的平均光密度值(0.483±0.124)，顯著高于生理鹽水組(0.219±0.071)(P＜0.05)。

圖7 斑蝥素酸鎂作用后人肝癌細胞SMMC-7721 裸鼠皮下移植瘤組織中bcl-2、bax 的表達(×400)Fig.7 The expressions level of bcl-2，bax of subcutaneous transplantation tumor from human hepatoma cells SMMC-7721 in nude mice treated by magnesium cantharidate(×400)

研究表明，細胞凋亡受細胞內多種基因調控［6］。其中，bcl-2 和bax 基因均屬于bcl-2 家族中的重要成員。bcl-2 基因是目前公認的重要的細胞凋亡調控基因，Schindler 等實驗發(fā)現(xiàn)bcl-2 基因可以通過抑制細胞凋亡，延長細胞壽命而促進腫瘤的發(fā)生［7］。而bax 是目前研究最深入的促凋亡基因之一，其編碼的Bax 蛋白能夠促進細胞凋亡［6］。本實驗采用免疫組化法檢測人肝癌裸鼠皮下移植瘤組織中bcl-2、bax 的表達水平，結果顯示斑蝥素酸鎂組瘤組織中bcl-2 的表達低于生理鹽水組，而bax 的表達高于生理鹽水組。

3 結論

本實驗通過對瘤體積大小、HE 染色組織形態(tài)學、透射電鏡、bax 和bcl-2 凋亡相關蛋白一系列指標的比較研究，初步探討了斑蝥素酸鎂的體內抗癌機制。研究結果顯示斑蝥素酸鎂能明顯抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤的增殖;并能誘導移植瘤細胞發(fā)生凋亡，其機制可能與上調bax 和下調bcl-2 表達有關。

1 Huang TK(黃泰康).Commonly used Traditional Chinese Medicine Composition and Pharmacological Manual，the Second Volume.Beijing:Chinese Medical Science and Technology Press，1994.1651.

2 Liu Y(劉云)，Hu SS(胡姍姍)，Lou FM(婁方明)，et al.Inhibitory effect of magnesium cantharidate on proliferation of lung adenocarcinoma.Lishizhen Med Mater Med Res(時珍國醫(yī)國藥)，2013，24:26-28.

3 Li XF(李曉飛)，Lou FM(婁方明)，Yan R(晏容)，et al.Inhibitory effect on human hepatoma QGY-7703 cell exposed to three kinds of cantharidate.Chin J Gerontol(中國老年學雜志)，2013，33:2049-2050.

4 Li XF(李曉飛).Magnesium cantharidate and its preparation method:Chinese，ZL201110149288.5，2013-04-17.

5 Wang W，Kim SH，El-Deiry WS.Small molecule modulators of p53 family signaling and antitumor effects in p53 deficient human colon tumor xenografts.Proc Nat Acad Sci USA，2006(29):11003-11008.

6 Guo QL(郭青龍).Oncological Pharmacology，Version 1.Beijing:Chemical Industry Press，2008.67-68.

7 Schindler CK，Shinoda S，Simon RP，et al.Subceller distribution of Bcl-2 family protein and 14-3-3 within the hippocam-pus during seizure-induced neuronal death in the rat.Neurosci Lett，2004，356:163-166.