李文芳，陳佰鴻，毛 娟，馬宗桓，楊世茂

（甘肅農業(yè)大學園藝學院，蘭州730070）

doi：10.3969/j.issn.1672－5565.2015.03.03

葡萄BRX基因家族生物信息學分析

李文芳，陳佰鴻?，毛 娟，馬宗桓，楊世茂

（甘肅農業(yè)大學園藝學院，蘭州730070）

BRX基因家族是一類植物特有的轉錄因子家族，在擬南芥中參與調節(jié)根細胞的增殖與伸長。利用生物信息學方法對葡萄基因組中存在的BRX基因家族進行了電子克隆，并對其進行了基因組的定位、蛋白質的結構、理化性質、二級結構及亞細胞定位的預測與分析，并對其與其它植物進化的親緣關系進行了研究。基因組定位結果發(fā)現(xiàn)：葡萄基因組中6個BRX基因集中分布在3條染色體上，其中VvBRX1和VvBRX2分布在第2條染色體上，VvBRX3和VvBRX4分布在第9條染色體上，VvBRX5 和VvBRX6分布在第11條染色體上；編碼蛋白的氨基酸數目為360～560個，VvBRX5的相對分子量（61 884.4）和理論等電點（9.38）均最大，而VvBRX1的相對分子量（40 239.1）和理論等電點（6.23）均最小。研究顯示，不同成員間氨基酸數目、氨基酸序列間存在一定的差異，但都為疏水性蛋白；α－螺旋和無規(guī)則卷曲為6個BRX氨基酸序列的主要組成部分；均不存在跨膜域及信號肽?；蚪Y構分析表明，6個BRX基因都含有外顯子和內含子結構。亞細胞定位分析表明：6個VvBRX基因均定位于細胞核。系統(tǒng)進化分析結果表明，VvBRX1、VvBRX2基因與胡楊的親緣關系最近，相似性達96％；VvBRX3、VvBRX4與蓖麻、麻瘋樹、柑橘、可可、大豆聚為一類，說明其進化關系較近；VvBRX5與其它VvBRX基因明顯分開；VvBRX6基因與蓮的親緣關系最近。試驗結果為葡萄BRX基因家族的克隆和功能分析奠定了一定的研究基礎。

葡萄；BRX基因家族；生物信息學分析

轉錄因子（Transcription factor，TF）又稱反式作用因子（Trans?acting factor），是一組能夠與順式作用元件（啟動子、增強子、調控序列和可誘導元件等）發(fā)生特異性結合，通過它們之間以及其它相關蛋白之間的相互作用，參與調節(jié)靶基因轉錄，并使之以特定的強度在特定的時間和空間表達的結合蛋白［1］。該蛋白的作用與細胞分化、多細胞生物的形態(tài)發(fā)育、器官的建成以及對外界刺激的反應密切相關。所有轉錄因子結構均含有兩個結構域——一個是DNA結合域（DNA binding domain），用于識別和結合順式作用元件的目標位點，另一個是轉錄激活域（Activatingdomain），用來組織其它參與激活轉錄的附加蛋白［2］。

BRX（Brevis Radix）基因家族屬于一類新的植物特有的轉錄因子家族。劉佳（2008）對水稻BRX基因家族的研究發(fā)現(xiàn)，這個家族的基因不僅僅參與調控多個激素途徑和根的發(fā)育，同時也很有可能是一類新的與植物非生物脅迫相關的轉錄因子。擬南芥中BRX是由自然變異形成的終止突變產生的新基因家族，主要通過控制油菜素內酯和生長素途徑來調節(jié)根細胞的增殖與伸長［3］。擬南芥中包含5個BRX基因家族的同源基因，它們的蛋白序列均含有兩個非常保守的BRX結構域，單個的BRX結構域是一個蛋白質相互作用的結構域，同時它也能在PRAF（PH，RCC1 and FYVE）家族找到。該BRX結構域行使著介導BRX和PRAF蛋白質家族在酵母（釀酒酵母）中的同型和異型相互作用的生物學功能，但是只有當兩個BRX結構域同時存在時BRX功能才能正常運作［4］。擬南芥BRX家族的5個基因的同源性雖然非常高，但是，他們并沒有冗余的生物學功能［4］。前人研究揭示，BRX基因的功能與細胞分裂素（Cytokinin，CTK）具有緊密的聯(lián)系，BRX基因突變會導致主根的縮短，降低CTK對側根抑制的敏感性［5］。BRX基因缺陷會導致油菜素內酯水平的下降，對主根的生長有很大影響，并且會間接影響到CTK條件下中柱鞘細胞對生長素的積累和響應，從而表現(xiàn)出側根受抑不敏感的現(xiàn)象［6］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，中柱鞘細胞在側根起始的第一次不均等分裂前就具有了局部生長素的積累和響應［5］。

葡萄（Vitis vinifera L.）歸于葡萄科葡萄屬，是起源最古老且是世界性重要果樹之一，同時，也是繼擬南芥、水稻和楊樹后完成全基因測序的第4種開花植物，其基因組大小約為擬南芥基因組的3到4倍（約為500Mbp）［7］，具有較高的營養(yǎng)、食療和經濟價值，因此葡萄分子生物學的進一步研究將逐漸成為學術界研究的重點代表對象之一［8］。本研究擬采用生物信息學工具與分析方法，對NCBI數據庫中已注冊的，來自蓖麻、大豆、葡萄、高粱、黃瓜、擬南芥、楊樹的BRX家族中各基因編碼的氨基酸序列進行基因組信息的挖掘與分析，進一步推測該基因家族的分子生物學功能，對于植物的遺傳改良及非生物逆境脅迫方面具有深遠的意義。

1 材料和方法

1.1 葡萄BRX基因家族成員的檢索

在NCBI（National center for biotechnology information）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中通過blastp在線檢索葡萄無冗余蛋白質數據庫，再利用Translate tool（http://web.expasy.org/translate/）和ScanProsite tool（http://prosite.expasy.org/scanprosite/）進行基因序列的翻譯和預測候選蛋白的BRX結構域，若該蛋白上同時存在兩個BRX結構域，則認為該候選蛋白屬于BRX蛋白家族，若未能檢測出同時存在的兩個BRX結構域或只有一個BRX結構域，則認為其不屬于該家族。在此基礎上通過 BLAST Server（http://www.genoscope.cns.fr/cgi?bin/blast＿server/projet＿ML/blast?result.pl？ref＝dc34a3dd6f19ccaa693ad3f1b935f228）尋找其對應的cDNA登錄號和 DNA序列，并將其定位于染色體上［9］。

1.2 葡萄BRX基因家族結構分析

根據檢索得到的cDNA和 DNA序列，利用GSDS 2.0（Gene Structure Display Server）（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線預測葡萄BRX蛋白的內含子和外顯子的組成［10］。

1.3 葡萄BRX基因家族的理化性質分析

使用 ProtParam［11］（http://expasy.org/tools/protparam.html）在線預測該蛋白家族的氨基酸理化性質（包括氨基酸數目、分子量、理論等電點、脂溶指數和不穩(wěn)定指數）；蛋白二級結構預測利用 HNN SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD［12］程 序 （http://npsa?pbil.ibcp.fr/cgi?bin/npsa＿automat.pl？page＝/NPSA/npsa＿hnn.html）完成；TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM－2.0/）進行蛋白質跨膜域分析；SignalP 4.1 server （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）完成信號肽的分析［13］；WoLF PSORT（http://www.genscript. com/psort/wolf＿psort.html）進行亞細胞定位分析［14］。

1.4 葡萄BRX基因家族系統(tǒng)進化樹構建

把VvBRX1、VvBRX2、VvBRX3、VvBRX4、VvBRX5、VvBRX6基因的 CDS區(qū)以 FASTA格式分別提交NCBI在線比對，選擇與其同源性較高的物種：川桑（Morus notabilis）：XM＿010112136.1、胡楊（Populus euphratica）：XM＿011029755.1、桃（Prunuspersica）：XM＿007210759.1、蓖麻（Ricinus communis）：XM＿002521302.1、柑橘（Citrus sinensis）：KK784904.1、可可（Theobroma cacao）：XM＿007024521.1、白梨（Bretschneideri）：XM＿009374097.1、蓮（Nelumbo nucifera）：XM＿010263665.1、麻瘋樹 （Jatropha curcas）：XM＿012213513.1、大豆（Glycine max）：XM＿003528399.2，然后利用MEGA5.0和Clustalx軟件構建系統(tǒng)發(fā)生樹［15］。

2 結果與分析

2.1 葡萄BRX挖掘和基因定位及蛋白理化性質分析

經葡萄基因 Blast?search（http://www. genoscope.cns.fr/cgi?bin/blast＿server/projetML/blast.pl）對比檢索，共得到6個候選的葡萄BRX氨基酸序列（見表1）。同時在 GenBank中搜索相應的cDNA登錄號和DNA序列［16］，并進行染色體定位，結果表明6個葡萄BRX基因分布在3條（第2、9、11條）染色體上，分布的數量都為2個（見表1）。

葡萄BRX蛋白家族的氨基酸數目分析結果顯示：它們的長度在360～560個氨基酸之間，其中VvBRX5所含氨基酸數目最多（560個），而VvBRX1最少（360個）；蛋白質的相對分子質量分析結果發(fā)現(xiàn)：VvBRX5的相對分子質量最大（61 884.4），而VvBRX1最小（40 239.1）；等電點的分析顯示：VvBRX1預測的等電點最低（6.23），而VvBRX5最高（9.38）；脂溶指數（Aliphatic index）分析結果表明：6個葡萄BRX翻譯蛋白的脂溶指數均小于100，說明它們都為疏水性蛋白，不穩(wěn)定指數（Instability index）分析表明：6個蛋白質的穩(wěn)定指數在45.52～57.66，歸為穩(wěn)定蛋白（見表1）。

表1 葡萄BRX挖掘和基因定位及蛋白理化性質分析Table 1 Grape BRX m ining and genemapping and analysis of protein physicochem ical properties

2.2 BRX基因家族的基因結構

葡萄BRX基因的結構分析表明，6個BRX基因均有內含子和外顯子，在第2條染色體上的VvBRX1 和VvBRX2基因均有6個外顯子和5個內含子；同在葡萄第9條染色體上的 VvBRX3和VvBRX4中有5個外顯子，分別被4個內含子分開；同在第11條染色體上的VvBRX5和VvBRX6基因中均有4個外顯子和3個內含子。且VvBRX1和VvBRX2、VvBRX3和VvBRX4、VvBRX5和VvBRX6基因有著非常一致的結構，相同位置的外顯子和內含子的大小都相差無幾，說明這些基因具有高度保守的結構域。（見圖1）。

圖1 BRX基因外顯子/內含子組成分析Fig.1 Composition analysis of BRX gene exon/intron

2.3 葡萄BRX基因家族蛋白質結構預測分析及亞細胞定位

跨膜域的預測結果顯示，葡萄6個BRX基因均不存在跨膜域，且無信號肽，因而可以推測為膜內蛋白。亞細胞定位分析顯示：葡萄6個BRX基因均定位于細胞核（見表2）。

表2 葡萄BRX基因蛋白的亞細胞定位Table 2 Subcellular localization of grape BRX gene protein

2.4 BRX基因家族蛋白質二級結構對比分析

葡萄6個BRX蛋白的二級結構主要由α－螺旋、無規(guī)則卷曲和擴展鏈結構3種形式構成，其中，無規(guī)則卷曲＞α－螺旋＞擴展鏈結構（見表3）。

2.5 葡萄BRX基因家族氨基酸序列的同源性比較

葡萄BRX氨基酸序列的同源性比較結果發(fā)現(xiàn)（見圖 2），所有 BRX氨基酸序列的同源性是60.35％，說明BRX基因家族的氨基酸序列同源性較高。所有BRX氨基酸序列兩兩比對發(fā)現(xiàn)，VvBRX3與VvBRX4的氨基酸序列同源性最高，高達97.84％。VvBRX1與VvBRX5的氨基酸序列同源性最低，低至49.91％。同在葡萄第2條染色體上的VvBRX1與VvBRX2的氨基酸序列同源性是81.22％，同在葡萄第9條染色體上的VvBRX3與VvBRX4的氨基酸序列同源性是 97.84％，同在葡萄第 11條染色體上的VvBRX5與VvBRX6的氨基酸序列同源性是64.64％。

表3 BRX基因蛋白二級結構對比分析Table 3 Com parative analysis of BRX gene protein secondary structure

2.6 BRX基因保守結構域的對比分析

保守結構域是蛋白質中能夠折疊成特定三維結構的、在生物進化或者一個蛋白家族中具有不變或相同的一段局部保守區(qū)域，其結構亞單位稱為模體（Motif），又稱基序，組成這些模體（或基序）的氨基酸區(qū)段行使著特異的生物學功能，且不能被改變，并蘊含各自的遺傳進化信息，通常決定一個基因家族［17］。葡萄6個BRX基因的中間段和末尾段都含有非常保守的兩個長56 aa的 BRX結構域（見圖3），從而構成了一個植物特異性轉錄因子大家族。這兩個高度保守區(qū)應該是BRX基因主要功能的信息區(qū)，也是不同物種以及同一物種基因家族的同源性所在。

2.7 葡萄BRX基因的系統(tǒng)發(fā)生分析

系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，葡萄的6個BRX基因可以明顯分為兩組，第11條染色體上的VvBRX5明顯分開，說明其可能有其它功能；第9條染色體上的VvBRX3、VvBRX4與蓖麻、麻瘋樹、柑橘、可可、大豆聚為一類，說明其進化關系較近；第11條染色體上的VvBRX6基因與蓮聚為一類；第2條染色體上的VvBRX1、VvBRX2基因與胡楊、川桑、桃聚為一類，其中與胡楊的親緣關系最近，相似性達96％（見圖4）。

圖3 利用Scan Prosite對VvBRX進行保守域搜索的結果Fig.3 Scan Prosite use for VvBRX conservative domain search results

圖4 植物來源的BRX基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the BRX gene sequence from plant

3 結論與討論

植物轉錄因子的研究是功能基因組學研究的熱點中的重點，也是生物科學的前沿領域之一。近年來，相繼從高等植物中分離出一系列調控非生物逆境脅迫（干旱、低溫及高鹽）、激素、病原等因子應答反應及與生長發(fā)育、代謝相關的轉錄因子基因，這些轉錄因子可以減少這些非生物逆境對植物造成的傷害，提高植物對多種逆境的適應和抗逆能力［18］。因此，對相關基因的研究不僅可以闡明植物對環(huán)境脅迫信號的應答機制，還能為作物抗逆性分子育種提供基因資源和一定的理論基礎，并有望進一步通過基因克隆技術來獲得抗逆性強的轉基因材料［19］。

葡萄是世界四大水果之一，它的根系在抗非生物逆境脅迫和提高產量等方面起著非常重要的作用。對葡萄中BRX基因家族進行多方面的分析鑒定，發(fā)現(xiàn)葡萄的BRX基因家族在根生長發(fā)育中起著非常重要的作用［20］，可能在葡萄的生長發(fā)育和抗逆中起著一定的調控作用?；蚴侨旧w上具有控制生物性狀的DNA片段［21］。6個蛋白都為疏水性蛋白，且6個基因之間有很高的相似性，都含有外顯子和內含子，功能域分析發(fā)現(xiàn)每條基因所翻譯的蛋白結構中都同時有兩個BRX結構域，說明它們都能夠表達，這與劉佳（2008）對水稻BRX基因家族的研究結果一致。

總的來說，轉錄因子的數量龐大，種類繁多，一個轉錄因子可參與調控多個基因的轉錄和表達，而一個基因的轉錄和表達又可受多個轉錄因子的的組合調控，從而形成復雜的調控網絡。對生根相關BRX基因家族的研究任重而道遠，相信隨著實驗技術和生物信息學的不斷發(fā)展，以及對植物生根轉錄表達譜及相關BRX候選基因的深入了解，葡萄BRX基因家族與根生長的分子調控網絡將會越來越清晰。此外，BRX基因家族除了與CTK作用于植物根系的生長外，對這個基因家族在應答非生物脅迫研究領域的生理與分子機制的進一步研究有助于我們更好地全面認識并完善植物逆境調控下的遺傳網絡系統(tǒng)。

［1］ AALTO M K，HELENIUS E，KARIOLA T.，et al. ERD15?An attenuator of plant ABA responses and stoma?tal aperture［J］.Plant Science，2012，182：19－28.

［2］ 張艷馥，沙偉.轉錄因子概述［J］.生物學教學，2009，34（10）：7－8. ZHANG Yanfu，SHA Wei.Overview of transcription fac?tors［J］.Biology Teaching，2009，34（10）：7－8.

［3］ 劉佳.水稻BRX家族的鑒定及OsBRX4基因功能初探［D］.武漢：華中農業(yè)大學，2008. LIU Jia.Identification of Rice BRX Family and Prelimi?nary Function Analysis of Gene OsBRX4［D］.Wuhan：Huazhong Agricultural University，2008.

［4］ LIU J，LIANG D C，SONG Y L，etal.Systematic identi?fication and expression analysis of BREVIS RADIX?like homologous genes in rice［J］.Plant Science，2010，178 （2）：183－191.

［5］ 李靜.擬南芥BRX基因在細胞分裂素介導的側根發(fā)生抑制中作用的研究［D］.杭州：浙江大學，2008. LI Jing.Functional Analysis of AtBRX in Regulation of Cytokinin?mediated Inhibition of Lateral Root Initiation ［D］.Hangzhou：Zhejiang University，2008.

［6］ LIX，MO X，SHOU H，et al.Cytokinin?mediated cell cycling arrest of pericycle founder cells in lateral root ini?tiation of arabidopsis［J］.Plant＆Cell Physiology，2006，47：1112－1123.

［7］ JAILLON O，AURY JM，NOEL B，et al.The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla［J］.Nature，2007，449：463－467.

［8］ 叢郁，楊順瑛，宋志忠，等.葡萄AMT基因家族生物信息學分析［J］.中國農學通報，2011，27（25）：193－199. CONG Yu，YANG Shunying，SONG Zhizhong，et al. Bioinformatics analysis of AMT protein family in grape ［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2011，27 （25）：193－199.

［9］ DENG W，NICKLE D C，LEARN G H，et al.Viro?BLAST：a stand?alone BLAST web server for flexible queries of multiple databases and user′s datasets［J］. Bioinformatics，2007，23（17）：2334－2336.

［10］HU B，JIN JP，GUO A Y，et al.GSDS 2.0：an upgra?ded gene feature visualization server［J］.Bioinformatics，2015，31（8）：1296－1297.

［11］BICKMORE W A，SUTHERLAND H G E.Addressing protein localization within the nucleus［J］.The EMBO Journal，2002，21（6）：1248－1254.

［12］MANN S，LIJ，CHEN Y PP.A pHMM?ANN based dis?criminative approach to promoter identification in pro?karyote genomic contexts［J］.Nucleic Acids Research，2007，35（2）：e12－e12.

［13］顏培玲，潘學軍，張文娥.野生毛葡萄水通道蛋白基因VhPIP1的克隆及其在干旱脅迫下的表達分析［J］.園藝學報，2015，42（2）：221－232. YAN Peiling，PAN Xuejun，ZHANGWen'e.Cloning of aquaporion gene VhPIP1 in vitis heyneana and its expres?sion under drought stress［J］.Acta Horticulturae Sinica，2015，42（2）：221－232.

［14］王明樂，王偉東，趙真，等.茶樹NADPH氧化酶基因的克隆、亞細胞定位與表達分析［J］.園藝學報，2015，42（1）：95－103. WANGMingle，WANGWeidong，ZHAO Zhen，et al.Mo?lecular cloning，subcellular localization and expression a?nalysis of NADPH oxidase gene from tea plant［J］.Acta Horticulturae Sinica，2015，42（1）：95－103.

［15］WANG M，VANNOZZIA，WANG G T，et al.Genome and transcriptome analysis of the grapevine（Vitis vinifera L.）WRKY gene family［J］.Citation：Horticulture Research，2014，1：1－16.

［16］AOKIY，TAKAHASHIS，TAKAYAMA D，etal.Identi?fication of laticifer?specific genes and their promoter regions from a natural rubber producing plant hevea bra?siliensis［J］.Plant Science，2014，225：1－8.

［17］CHEN JQ，YIN H，GU JP，et al.Genomic character?ization，phylogenetic comparison and differential expres?sion of the cyclic nucleotide?gated channels gene family in pear（Pyrus bretchneideri Rehd.）［J］.Genomics，2015，105（1）：39－52.

［18］LIU C F，ZOU J，CHEN X B.Advances in DREB tran?scription factors and plantabiotic stress tolerance［J］.Bi?otechnology Bulletin，2010，10：006.

［19］ZHAO Y X，LIU P，XU Z S，et al.Analysis of specific binding and subcellular localization of wheat ERF tran?scription factor W17［J］.Agricultural Sciences in China，2008，7（6）：647－655.

［20］SCACCHIE，SALINASP，GUJASB，et al.Spatio?tem?poral sequence of cross?regulatory events in rootmeristem growth［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2010，107（52）：22734－22739.

［21］LóPEZ?KLEINE L，PINZóN A，CHAVES D，et al. Chromosome 10 in the tomato plant carries clusters of genes responsible for field resistance/defence to phytoph?thora infestans［J］.Genomics，2013，101（4）：249－255.

Bioinformatics analysis of the BRX gene family in grape

LIWenfang，CHEN Baihong?，MAO Juan，MA Zonghuan，YANG Shimao
（College ofHorticulture，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

BRX gene family is a class of transcriptional factors that present only in plant，and it plays an important role in the regulation of cell proliferation and root elongation in Arabidopsis.With the approaches of bioinformatics，BRX gene family present in the grape genome was performed in silico cloning，genome localization，protein structure，physical and chemical characteristics，secondary structure as well as subcellular localization prediction and analysis.Moreover，the evolutionary relationships of BRX gene family derived from other plantswere predicted. Genomemapping results showed that：6 BRX genes in grape genome were located on 3 chromosomes，VvBRX1 and VvBRX2 in chromosome 2，VvBRX4 and VvBRX3 in chromosome 9，VvBRX6 and VvBRX5 in chromosome 11.The encoded proteins contain 360－560 amino acids，the relativemolecularweight（61 884.4）and the p Ivalue（9.38）of VvBRX5 were the maximum，while the relative molecular weight（40 239.1）and the pI value（6.23）of VvBRX1 were the minimum.The study suggested that there were some differences between the amino acid sequences of differentmembers，while they allwere hydrophobic proteins.The 6 BRX amino acid sequencesmainly contain alpha helix and random coil and did not have transmembrane domains and signal peptide.Gene structure analysis showed that the 6 BRX genes contained exons and introns structure.Subcellular localization analysis showed that six VvBRX genes are located in nucleus.Phylogenetic analysis showed that VvBRX1 and VvBRX2 had the closest relationship with populus euphratica，the homology was 96％.VvBRX3 and VvBRX4 were clustered a classwith Ricinus communis，Jatropha curcas，Citrus sinensis，Theobroma cacao and Glycine max，indicating that the evolutionary relationshipswere very closer.VvBRX5 was significantly separated from other VvBRX genes.VvBRX6 had the closest relationship with Nelumbo nucifera.These experimental results provide a significant foundation for further research on function analysis of the BRX gene family in grape genome.

Grapevine；BRX gene family；Bioinformatics analysis

S663.1；Q343.1

A

1672－5565（2015）03－158－07

2015－03－15；

2015－06－05.

甘肅省農牧廳農業(yè)科技創(chuàng)新項目（GNCX－2013－38）；甘肅省自然基金（1308RJYA062）；國家自然科學基金（31460500）。

李文芳，女，本科生，研究方向：果樹生理與生物技術；E?mail：1304784689＠qq.com.

?

陳佰鴻，男，教授，研究方向：果樹生理與生物技術；E?mail：bhch＠gsau.edu.cn.