李 麗，劉德榮，李新梅，趙小英，劉選明（湖南大學(xué)生物學(xué)院，長(zhǎng)沙410082）

doi：10.3969/j.issn.1672－5565.2015.03.02

受赤霉素調(diào)節(jié)的擬南芥F?box基因篩選分析

李 麗，劉德榮，李新梅，趙小英?，劉選明?
（湖南大學(xué)生物學(xué)院，長(zhǎng)沙410082）

赤霉素（Gibberellins，GAs）作為一種植物激素，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要調(diào)控作用，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步完善。F?box蛋白是SCF復(fù)合體的一個(gè)亞基，通過(guò)特異性識(shí)別底物來(lái)調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究采用生物信息學(xué)方法，通過(guò)分析擬南芥基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)提供的數(shù)據(jù)篩選到38個(gè)受GA調(diào)節(jié)的候選F?box基因，并對(duì)其中6個(gè)基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。PlantCARE分析顯示，其中30個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)具有GA響應(yīng)元件、以及IAA、ABA、光、溫度干旱脅迫、或生物鐘相關(guān)的順式作用元件。通過(guò)分析BioGrid數(shù)據(jù)庫(kù)提供的相互作用對(duì)象，發(fā)現(xiàn)其中18個(gè)候選F?box蛋白與GA2ox1，GA3ox1和GA3ox3具有相互作用關(guān)系?；虮磉_(dá)譜分析表明，這些候選F?box基因在擬南芥各個(gè)組織器官中都有不同程度的表達(dá)，對(duì)IAA、ABA、光、溫度干旱等脅迫或不同光周期都具有一定的響應(yīng)。為深入研究GA調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制提供了重要線(xiàn)索。

赤霉素；F?box基因；擬南芥；基因芯片

赤霉素（Gibberellins，GAs）是一類(lèi)雙萜類(lèi)植物激素，它在植物的各個(gè)生理學(xué)過(guò)程中起促進(jìn)作用，包括種子的萌發(fā)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、開(kāi)花以及各種生物和非生物脅迫響應(yīng)等［1－4］?；钚訥As的水平通常是受到嚴(yán)格調(diào)控的，并且在特定的作用位點(diǎn)積累來(lái)調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育［5－8］。目前就GAs合成途徑的研究比較詳細(xì)，它需要一系列酶的參與，其中關(guān)鍵酶GA20－氧化酶（GA20ox）和GA3－氧化酶（GA3ox）的豐度在很大程度上決定著活性GAs的水平，然而另一種關(guān)鍵酶GA2－氧化酶（GA2ox）能使活性GAs失活［9－12］。對(duì)于GA信號(hào)途徑，始于GA與其受體GID1（在擬南芥中有：GID1A，GID1B和GID1C）結(jié)合，然后促進(jìn)GA－GID1－DELLA復(fù)合物的形成，進(jìn)而啟動(dòng)DELLA蛋白的泛素化降解，從而解除DELLA蛋白的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)［13－15］。

SCF復(fù)合體是眾多E3泛素連接酶中的一種，其組成亞基之一，F(xiàn)?box蛋白能特異性識(shí)別底物，從而介導(dǎo)靶蛋白的降解［16］。在擬南芥中，當(dāng)GA存在的情況下，F(xiàn)?box蛋白SLY1就通過(guò)與DELLA蛋白直接相互作用使其被泛素化降解，進(jìn)而促進(jìn)植物對(duì)GA的應(yīng)答［17］。擬南芥基因組中約存在700多個(gè)F?box基因［18］，大多數(shù)F?box基因的功能尚不清楚。那么是否還存在其它更多的F?box基因參與到復(fù)雜的GA信號(hào)途徑中呢？

我們采用生物信息學(xué)方法，試圖挖掘擬南芥中受GA調(diào)節(jié)的F?box基因，分析這些候選F?box基因上游啟動(dòng)子中的順式作用元件，組織器官表達(dá)譜、對(duì)各種環(huán)境因子如光、溫度、不同光周期等的響應(yīng)表達(dá)譜，預(yù)測(cè)這些基因的編碼蛋白與GA合成代謝及信號(hào)途徑關(guān)鍵酶和蛋白因子之間的相互作用關(guān)系，為深入研究GA調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制提供重要線(xiàn)索和思路。

1 材料和方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)下載

登錄NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi. nlm.ni h.gov/gds），以“Gibberellin”和“Arabidopsis”為關(guān)鍵詞檢索，分別下載登錄號(hào)（Accession）GSE29699，GSE35408，GSE39384，GSE6150和GSE7353等5組芯片數(shù)據(jù)。挑選芯片數(shù)據(jù)時(shí)，僅選取GA處理野生型擬南芥的數(shù)據(jù)，多種激素處理或GA處理突變體的芯片全部排除，以確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

1.2 芯片數(shù)據(jù)分析

利用RMAExpress將原始芯片數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化［19］，然后用自定義的perl程序篩選表達(dá)量有差異的基因。同時(shí)滿(mǎn)足下列條件的基因被認(rèn)定受GA調(diào)節(jié)的候選F?box基因：（1）該基因的表達(dá)值大于或等于本組芯片所有表達(dá)值的25％分位值；（2）GA處理后該基因的表達(dá)量上調(diào)或下調(diào)1.4倍以上（P＜0.05）；（3）該基因的表達(dá)變化趨勢(shì)（升高或降低）至少在2組芯片中表現(xiàn)一致。

1.3 啟動(dòng)子分析

從Tair網(wǎng)站（http://www.arabidopsis.org/）下載基因的啟動(dòng)子（起始密碼子上游1 500 bp的序列），利用PlantCARE網(wǎng)站（http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）提供的在線(xiàn)分析工具分析所有序列［20］，并統(tǒng)計(jì)和GA、IAA、ABA、光、溫度干旱脅迫及生物鐘相關(guān)的順式作用元件。

1.4 候選基因的表達(dá)譜和相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

利用Genevestigator（http://genevestigator.com/gv/）分別分析候選F?box基因在不同激素（ABA、IAA）、光、溫度（冷、熱）、干旱、光周期和不同組織中的表達(dá)情況［21］。利用Cytoscape分析候選F?box基因編碼蛋白與GA合成代謝途徑及信號(hào)途徑關(guān)鍵酶和蛋白因子的相互作用情況［22］，分析過(guò)程僅以BioGrid數(shù)據(jù)庫(kù)提供的相互作用數(shù)據(jù)為對(duì)象［23］。由于整個(gè)相互作用網(wǎng)絡(luò)比較復(fù)雜，對(duì)GA與候選F?box蛋白建立連接沒(méi)有影響的其它蛋白已被移除。

1.5 GA處理

首先對(duì)擬南芥野生型Col－0種子進(jìn)行表面消毒，即：用70％的乙醇消毒30s，然后加入1.5％的次氯酸鈉（NaClO），使種子完全淹沒(méi)其中，并不斷晃動(dòng)確保消毒效率，10min后用無(wú)菌水將種子清洗5次。接著，將消毒后的種子播種于1/2MS培養(yǎng)基上，于4℃黑暗下低溫處理4d，然后轉(zhuǎn)到持續(xù)白光下生長(zhǎng)，6d后，用50μmol的GA3噴灑幼苗，分別于0、0.5、1.5、3、6、9、12h后收集材料（GA處理前收集材料的時(shí)間點(diǎn)定為0h），在液氮中速凍，然后保存于－80℃，用于RNA分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

首先用RNAiso Plus試劑（Takara，Japan）提取材料中的總RNA，然后參照試劑盒提供的說(shuō)明，用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara，Japan）將RNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。隨后，用SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（Takara，Japan）試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在Mx3000 Real?time PCR系統(tǒng)（Stratagene，The Netherlands）中進(jìn)行，PCR程序?yàn)椋?5℃5min，95℃30 s，58℃20 s，72℃30 s，根據(jù)基因本底表達(dá)水平的差異，設(shè)計(jì)不同的循環(huán)數(shù)，一般為40個(gè)循環(huán)。PCR引物為：At1g23390（5′?AAG CTTCTCGATCTCTGTCCCG?3′和5′?ATCCCTCT TAGTTTCTCCAAATACG?3′）； At1g61340 （5′?GAG AGTCTTTGTTAATTCAGCGAGT?3′和 5′?ATGTG ACTGCTTTGCTATCATTGTA?3′）；At1g78280 （5′?GTGGTTGGTGGCACTGTATCCT?3′和5′?TCATC CGTGTCCTCTTCTCTTT?3′）；At3g61060（5′?ACGG GTCGTCTTTGTTTATCTATTT?3′ 和 5′?TCCTTCCAAGCCTCTTTGATGTTTT?3′）；At4g21510（5′?TCT CGACTTGAGTGTCTCCCTC?3′ 和 5′?GCTCTTTC CTCTTAGCCTTGGT?3′）；At5g50450 （5′?ACGCTC TTACCTCTCTCTGAAATC?3′ 和 5′?CCGACCCGA ACTAAACCACTCT?3′）；Actin2（5′?CACTGTGCCAA TCTACGAGGGT?3′和 5′?ACAAACGAGGGCTGG AACAAG?3′）。以擬南芥持家基因ACTIN2的表達(dá)水平作為內(nèi)參計(jì)算待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)水平［24］。每一個(gè)數(shù)據(jù)代表三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果和分析

2.1 受GA調(diào)節(jié)的擬南芥F?box基因篩選及其啟動(dòng)子分析

在擬南芥基因組中約存在700多個(gè)F?box基因，為了初步確定哪些F?box基因可能為GA途徑相關(guān)基因，我們首先采用生物信息學(xué)方法篩選受GA調(diào)節(jié)的 F?box基因。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/（GEO）網(wǎng)站中共下載了5組基因芯片，分別是 GSE29699，GSE35408，GSE39384，GSE6150和GSE7353，用RMAExpress將原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，然后用自定義的perl程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果篩選到38個(gè)受GA調(diào)節(jié)（在P＜0.05時(shí)，上調(diào)或者下調(diào)1.4倍以上）的候選F?box基因（見(jiàn)表1）。隨后，對(duì)這38個(gè)基因起始密碼子上游1 500 bp啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中30個(gè)基因的上游啟動(dòng)子區(qū)具有不同數(shù)量的GA響應(yīng)元件GARE－motif（見(jiàn)表1），進(jìn)一步說(shuō)明這些基因可能是GA反應(yīng)相關(guān)基因。此外，還發(fā)現(xiàn)這些基因的啟動(dòng)子序列中具有光、激素、溫度和干旱脅迫、或光周期等環(huán)境因子響應(yīng)元件（見(jiàn)表1）。

表1 38個(gè)候選F?box基因的統(tǒng)計(jì)Table 1 The statistics of 38 selected F?box genes

續(xù)（表1）

2.2 部分候選F?box基因表達(dá)鑒定

為了進(jìn)一步確定芯片分析結(jié)果的可靠性，我們從中挑選了6個(gè)在芯片中表達(dá)量改變倍數(shù)較大的F?box基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定，這些基因分別是At1g23390，At1g61340，At1g78280，At3g61060，At4g21510和At5g50450。芯片結(jié)果中（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE6150），在GA處理0.5 h時(shí)，At1g23390的表達(dá)水平下降2.2倍，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，在1 h和3 h時(shí)，其表達(dá)水平有所回升，而At1g61340的表達(dá)變化趨勢(shì)則相反，在GA處理0.5 h時(shí)的表達(dá)水平較對(duì)照上升了 4.7倍，然后隨著時(shí)間推移，逐漸下降；At1g78280和At3g61060對(duì)GA的反應(yīng)相對(duì)較慢，GA處理1 h后，其表達(dá)水平才有顯著的升高，分別是對(duì)照的1.6倍和2.1倍，在3 h時(shí)，與對(duì)照相比，稍微有所降低；At5g50450則在GA處理0.5 h、1 h和3 h下，其mRNA水平逐漸升高。

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析結(jié)果表明，這6個(gè)F?box基因?qū)ν庠碐A均有響應(yīng)（見(jiàn)圖1），并且變化趨勢(shì)與芯片結(jié)果大體一致。例如，At1g23390和At1g61340對(duì) GA的響應(yīng)較迅速，在 GA處理后0.5 h就分別達(dá)到表達(dá)水平的最低值和峰值，分別下降和升高1.7倍和 1.9倍（見(jiàn)圖 1a，b）；At1g78280和At3g61060在GA處理6 h時(shí)，其表達(dá)水平較對(duì)照分別降低了1.47和1.69倍（見(jiàn)圖1c，d）。進(jìn)一步證實(shí)了篩選結(jié)果的可靠性。

圖1 外源GA3處理對(duì)6個(gè)候選F?box基因表達(dá)的影響Fig.1 The effect of exogenous GA3treatment on themRNA expression of 6 candidate F?box genes

2.3 候選F?box蛋白與GA途徑關(guān)鍵蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

為了進(jìn)一步分析候選F?box基因與GA的關(guān)系，我們利用BioGrid數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的相互作用對(duì)象，用Cytoscape軟件分析38個(gè)候選F?box蛋白與GA途徑關(guān)鍵酶和蛋白因子（GA20ox、GA3ox、GA2ox、GID1和DELLA）之間是否存在直接或間接相互作用關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)F?box蛋白At1g68050（FKF1）與GA2ox1和GA3ox3具有相互作用關(guān)系，其它17個(gè)F?box蛋白（圖2中粗線(xiàn)框標(biāo)記部分）通過(guò)SCF復(fù)合體組成亞基Skp1相關(guān)蛋白Skp1 HOMELOGUE 1、Skp1?like2和At1g22920與GA2ox1、GA3ox1和GA3ox3蛋白間有關(guān)聯(lián)（見(jiàn)圖2），表明這18個(gè)F?box基因可能參與調(diào)控GA的合成和代謝。

2.4 候選F?box基因的表達(dá)譜分析

2.4.1 不同組織器官中的表達(dá)譜分析

由于GAs通常是在植物特定的功能部位積累并發(fā)揮作用［5－8］，因此我們對(duì)候選的38個(gè)F?box基因在擬南芥不同組織器官中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。從圖3中可以看出，At1g78100、At2g41170和At3g08810這3個(gè)基因在所有組織中的表達(dá)都是極其低的，At1g47790和At3g49510只在果莢中表達(dá)較高，可能參與調(diào)控果莢及種子的發(fā)育；At3g20710和At5g60610只在雄蕊中有一定量的表達(dá)，可能參與花和雄蕊的發(fā)育；其它F?box基因的表達(dá)則相對(duì)廣泛，在擬南芥幼苗、下胚軸、花、果莢和根中都有不同程度的表達(dá)，表明這些基因可能參與了植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)控。

2.4.2 不同激素、光、溫度和干旱脅迫及不同光周期下的表達(dá)譜分析

圖3 候選F?box基因在擬南芥不同組織中的表達(dá)譜Fig.3 The expression profile of candidate F?box genes in different tissues of Arabidopsis

由于其它激素，如生長(zhǎng)素可以調(diào)控GAs的合成［1］，且激素之間通?？梢孕纬蓮?fù)雜的交叉調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)GA也可以將環(huán)境信號(hào)如光、非生物脅迫及光周期等信號(hào)進(jìn)行整合，進(jìn)而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，從而使植物適應(yīng)外界環(huán)境的變化［25－30］。因此，我們利用Genevestigator分析了38個(gè)候選F?box基因響應(yīng)IAA、ABA、光、溫度和干旱脅迫及不同光周期的表達(dá)譜。

從圖4中可看出，大部分F?box基因?qū)@些環(huán)境因子及激素都有一定的響應(yīng)，其中對(duì)環(huán)境因子的應(yīng)答較強(qiáng)烈。具體而言，在上述因子分別作用下其表達(dá)水平上調(diào)或下調(diào)超過(guò)2倍（P＜0.05）的F?box基因有，激素 （ABA、IAA）處理下：At1g10780，At1g21410， At1g80440， At3g23880， At3g61060，At5g06550；不同光下：At1g23390，At1g80440；光周期影 響 下： At1g15670， At1g23390， At1g61340，At1g63090， At1g78100， At1g80440， At2g44130，At3g23880，At3g61060，At4g21510；脅迫影響下：At1g10780， At1g15670， At1g21410， At1g23390，At1g61340，At1g80440，At3g61060。綜合而言，對(duì)各種環(huán)境因子都響應(yīng)顯著的基因?yàn)椋篈t1g23390和At1g80440，這2個(gè)基因可能通過(guò)GA信號(hào)通路，參與激素間的交叉會(huì)話(huà)以及植物對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)。

圖4 候選F?box基因在不同激素或環(huán)境因子影響下的表達(dá)譜Fig.4 The expression profile of candidate F?box genes under different environment factors or hormones

3 討 論

本研究通過(guò)基因芯片分析，總共篩選到表達(dá)水平受GA上調(diào)或下調(diào)1.4倍以上的F?box基因38個(gè)。通過(guò)對(duì)這38個(gè)基因上游1 500 bp啟動(dòng)子區(qū)分析，發(fā)現(xiàn)其中30個(gè)基因都具有GA響應(yīng)元件GARE?motif，以及其它激素或者環(huán)境因子響應(yīng)元件，如IAA、ABA、光、生物鐘或溫度及干旱等響應(yīng)元件，表明這些基因可能在GA信號(hào)通路以及植物對(duì)外界環(huán)境變化的響應(yīng)中起重要作用。

從38個(gè)基因中挑選了6個(gè)在芯片分析結(jié)果中表達(dá)量改變較大的基因進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定，證實(shí)這6個(gè)基因?qū)ν庠碐A均有不同程度的響應(yīng)，并且與芯片結(jié)果大體一致。此外，通過(guò)對(duì)BioGrid數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的相互作用對(duì)象分析，發(fā)現(xiàn)一些候選 F?box蛋白與 GA合成代謝途徑關(guān)鍵酶GA3ox1、GA3ox3和GA2ox1具有一定的相互作用關(guān)系，但是在植物體內(nèi)是否存在相互作用，是間接互作還是直接互作，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

植物體內(nèi)GAs的水平受到嚴(yán)格調(diào)控并且在特定的功能位點(diǎn)積累進(jìn)而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育［5－8］。通過(guò)對(duì)38個(gè)候選F?box基因的表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)大部分基因在擬南芥幼苗、下胚軸、花和根中有不同程度的表達(dá)，而這些部位的生長(zhǎng)發(fā)育也受到GA的調(diào)控［1－4］。GAs不僅直接調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，還能通過(guò)對(duì)環(huán)境信號(hào)，如光、溫度和干旱等非生物脅迫及生物鐘等進(jìn)行整合進(jìn)而對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行調(diào)控［25－30］。本研究篩選到的受GA調(diào)節(jié)的部分候選F?box基因?qū)Σ煌?、光周期及脅迫具有很強(qiáng)的響應(yīng)，同時(shí)對(duì)激素ABA和IAA也有不同程度的應(yīng)答。推測(cè)這些基因可能通過(guò)GA信號(hào)通路參與植物生長(zhǎng)發(fā)育，以及植物對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)。

總之，通過(guò)生物信息學(xué)方法，我們篩選到了一系列響應(yīng)GA的F?box基因，并可能通過(guò)GA信號(hào)通路參與植物對(duì)環(huán)境因子的應(yīng)答。因此，本研究結(jié)果為我們今后深入研究GA調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制提供了重要線(xiàn)索。

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Screening and analysis of gibberellin?regulated F?box genes in Arabidopsis

LI li，LIU Derong，LIXinmei，ZHAO Xiaoying?，LIU Xuanming?
（College ofBiology，Hunan University，Changsha 410082，China）

Gibberellins（GAs）act as one plant hormone，which play an important role in the regulation of plant growth and development，but themolecularmechanism for GA?mediated plant growth regulation remains to be perfect further.F?box proteins are the subunits of SCF complex and also control the plant growth and development via the specific recognition of substrates.In this study，38 candidate F?box genes regulated by GA were selected through the analysis of genemicroarray data in Arabidopsis using bioinformaticsmethods，and six ofwhich were verified by real?time PCR.Furthermore，Plant CARE results show that there are thirty F?box genes with GA response elements and other elements involved in IAA，ABA，light，temperature and drought stresses or circadian clock in the promoter sequence.Besides，the analysis of interactions of proteins provided by BioGrid databases show thateighteen candidate F?box proteins have director indirect correlation with GA2ox1，GA3ox1 and GA3ox3.The gene expression profiles tell us that the candidate F?box genes express at all tissues and organs in Arabidopsis，and have responses to IAA，ABA，light，temperature and drought stresses，or photoperiod.Our results in this paper provide important clues for further study themolecularmechanism of plant growth and development regulated by GAs.

GA；F?box gene；Arabidopsis；Genemicroarray

Q343.1

A

1672－5565（2015）03－150－08

2015－04－03；

2015－05－04.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No：31171176）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No：11JJA002）。

李麗，女，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學(xué)；E?mail：957800401＠qq.com.

?

趙小英，女，教授，碩導(dǎo)，研究方向：植物赤霉素和光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；E?mail：zxy＿mm＠163.com；

劉選明，男，教授，博導(dǎo)，研究方向：植物功能基因組學(xué)、植物發(fā)育分子生物學(xué)、生物質(zhì)再生能源等；E?mail：xml05＠126.com.