張 航 楊 梅

（貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗科，貴州 貴陽550001）

隨著流式細(xì)胞術(shù)（FCM）對AL免疫分型檢測的應(yīng)用，大大提高了AL分型的準(zhǔn)確性，AL形態(tài)分型與臨床的符合率僅有70%左右，結(jié)合免疫分型后AL分型準(zhǔn)確率可達(dá)到90%以上。現(xiàn)就應(yīng)用FCM對我院75例初診AL患者進(jìn)行免疫表型分型的資料分析如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機(jī)選擇75例經(jīng)FAB分型初診為AL的我院2011年3月至2014年6月住院患者，男性39例，女性36例；年齡13～77歲。按FAB分型標(biāo)準(zhǔn)［1］分為：急性髓系白血?。ˋML）45例，其中M02例，M19例，M220例，M34例，M45例，M54例，M61例；急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）25例，其中L17例，L213例，L35例；另有5例未能明確分型。

1.2 儀器與試劑 流式細(xì)胞分析儀為美國Beckmen Coulter公司生產(chǎn)，型號Epics－XL；試劑為美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的單克隆抗體，髓系標(biāo)志抗體有：MPO、CD13、CD14、CD33、CD41、CD117、GlyA；T淋巴標(biāo)志抗體有：cCD3、CD2、CD5、CD7；B淋巴標(biāo)志抗體有：cCD79a、CD10、CD19、CD20；NK細(xì)胞抗體有：CD（16＋56）；非系列抗體有：CD45、CD34、HLA－DR；同型對照抗體：IgG1、IgG2a；白細(xì)胞破膜劑、紅細(xì)胞溶血劑均購自貝克曼庫爾特公司。

1.3 方法 胞膜抗原檢測，采用三色熒光抗體直接標(biāo)記肝素抗凝的骨髓懸液（細(xì)胞數(shù)＞1×106／mL），每管加熒光抗體20μL，加骨髓懸液100μL，混勻置室溫避光反應(yīng)30min，同時做同型對照；加溶血劑3mL溶血30min后，用PBS洗滌1次，加0.5mL PBS重懸待測；胞質(zhì)抗原檢測：采用四色熒光抗體標(biāo)記經(jīng)破膜處理過的骨髓白細(xì)胞，每管加熒光抗體20μL，經(jīng)破膜的骨髓白細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)＞1×106／mL）100μL，混勻置室溫避光反應(yīng)30min，同時做同型對照，用PBS洗滌1次，加0.5mL PBS重懸待測。FCM檢測分型，流式細(xì)胞儀檢測，每次計數(shù)10 000個細(xì)胞以上，通過側(cè)向散射光信號（SSC）與CD45雙參數(shù)散點圖設(shè)門，框選出異常細(xì)胞群（原幼細(xì)胞群），分析門內(nèi)細(xì)胞胞膜或胞質(zhì)白血病抗原的表達(dá)情況；細(xì)胞膜抗原表達(dá)率≥20%，細(xì)胞質(zhì)抗原表達(dá)率≥10%，判定為陽性表達(dá)；免疫分型依據(jù)國際白血病歐洲協(xié)作組（EGIL）的積分標(biāo)準(zhǔn)［2］。

2 結(jié) 果

45例AML，單純型AML31例，Ly＋AML14例，各 抗 原 陽 性 率 依 次 是 CD13（95.56%）、CD33（86.67%）、MPO（82.22%）、CD117（71.11%）、HLADR（62.22%）、CD7（26.67%）、CD14（20.00%）、CD5（13.33%）、CD19（4.44%）。10例 T－ALL，單純 TALL8例，My＋T－ALL2例，各抗原陽性率依次是CD2（100%）、cCD3（100%）、CD7（90.00%）、CD5（70.00%）、CD13（28.57%）。14例 B－ALL，單純 BALL11例，My＋B－ALL 3例，各抗原陽性率依次是CD19（100%）、CD79a （92.86%）、CD10（71.42%）、CD20（57.14%）、CD13（14.29%）、CD33（7.14%）。FAB不能明確分型的5例AL，4例為MAL，其中2例 AML／T－ALL，主要表達(dá)抗原有CD13、CD33、CD2、CD7、MPO、cCD3、HLA－DR、CD34；1 例 JJAML／BALL，主要表達(dá)抗原有 CD13、CD14、CD10、CD19、MPO、cCD79a、CD34；1例AML／T－ALL／B－ALL，主要表達(dá) 抗 原 CCD13、CD33、CD7、CD10、MPO、cCD3、cCD79a、HLA－DR、CD34。另1例表達(dá)CD2、CD7、CD（16＋56），符合NK細(xì)胞白血病表型。1例FAB形態(tài)初診ALL－L2的患者，最后通過免疫分型確診為AUL，表達(dá)抗原有CD34、HLA－DR、CD7。見表1。

表1 75例AL免疫表型

3 討 論

CD45是所有白細(xì)胞的共同抗原，但不同白細(xì)胞和不同分化階段CD45的表達(dá)強(qiáng)度不同，SSC反映細(xì)胞顆粒性和成熟度，所以利用SSC／CD45雙參數(shù)散點圖設(shè)門，能有效地把白血病細(xì)胞群（原始／幼稚細(xì)胞）和正常細(xì)胞群區(qū)分開來［3］。FCM進(jìn)行白血病免疫分型獲得白血病細(xì)胞的抗原表達(dá)信息，用系列積分法將其分為單純型AML、單純型ALL、變異型（Ly＋AML和 My＋ALL）、MAL、AUL。本資料45例AML中，陽性率靠前的抗原分別是 CD13（95.56%）、CD33（86.67%）、MPO（82.22%）、CD117（71.11%），可見 CD13、CD33、MPO對髓系白血病的診斷具有重要意義，尤其是胞質(zhì)MPO對診斷AML有決定性作用。有研究顯示CD117極少表達(dá)于ALL，所以CD117被作為鑒別AML和ALL的重要抗原［4］；CD34是干／祖細(xì)胞相關(guān)抗原，隨著造血細(xì)胞的分化成熟而逐漸消失，CD34、HLA－DR多表達(dá)于低分化類型M0、M1、M4、M5，分化較成熟的 M3極少表達(dá)，本研究中的4例M3高表達(dá)CD13和CD33，不表達(dá)CD34、HLA－DR，與文獻(xiàn)報道一致［5］。研究中1例患者在SSC／CD45散點圖中出現(xiàn)兩群異常細(xì)胞，其中一群細(xì)胞C45＋主要表達(dá)CD13、CD33、CD117、CD34、HLA－DR，而另一群CD45－僅有GlyA表達(dá)，結(jié)合形態(tài)符合M6；變異型（Ly＋AML）14例，以CD7表達(dá)常見，其次是CD5、CD19。

現(xiàn)有的FAB分別標(biāo)準(zhǔn)很難區(qū)分T－ALL和BALL，而FCM免疫分型就可以根據(jù)白血病細(xì)胞抗原的表達(dá)信息將其明確分開。本研究中10例TALL，主要表達(dá)抗原是CD2、cCD3、CD7、CD5，以上抗原診斷T－ALL具有很高價值，尤其是胞質(zhì)抗原cCD3最為特異。14例B－ALL主要表達(dá)抗原是CD19、cCD79a、CD10、CD20，這些抗原對診斷 BALL具有很高價值，以胞質(zhì)抗原cCD79a最為特異。My＋ALL 5例，以CD13表達(dá)常見、其次是CD33。因此FCM免疫分型對ALL判斷細(xì)胞來源，區(qū)分TALL和B－ALL及亞型都具有重要意義。

本研究中FAB不能明確分型的5例AL患者，通過FCM免疫分型表達(dá)抗原積分法顯示，明確4例為MAL，其中2例同時表達(dá)髓系和T淋巴系抗原，1例同時表達(dá)髓系和B淋巴系抗原，1例同時表達(dá)髓系和T、B淋巴系抗原，系屬抗原積分均＞2分。胞質(zhì)抗原MPO、cCD3、cCD79a積分均為2分，可見MPO、cCD3、cCD79a對鑒別混合白血病具有重要意義?；旌习籽≡\斷中對于僅表達(dá)個別或次要相關(guān)抗原，系屬積分＜2分，不能診斷為雙系或雙表型白血病，應(yīng)歸為Ly＋AML或My＋ALL。由于白血病細(xì)胞起源和分化的異質(zhì)性，MAL可能表型為雙系列或雙表型、雙克隆甚至多種類型組成的混合型，在實際工作中要明確分類較為困難，需要進(jìn)一步研究。NK細(xì)胞白血病特異表型為CD3－／CD（16＋56）＋，本研究中1例FAB不能明確分型的患者通過FCM免疫分型符合NK細(xì)胞白血病表型。AUL特點是無系屬抗原表達(dá)，但常有非系屬抗原CD34、HLA－DR及CD7表達(dá)［6］，本研究中1例患者FAB初診為ALL－L2，經(jīng)FCM免疫分型的結(jié)果顯示是CD34＋／HLA－DR＋／CD7＋，其它系屬抗原均為陰性，最終確診為AUL。

應(yīng)用FCM對白血病免疫分型，具有特異、準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好的特點，彌補(bǔ)了FAB形態(tài)分型的不足，提高了AL診斷的準(zhǔn)確性，尤其是對復(fù)雜類型白血病的診斷具有重要價值。

［1］ 張之南，沈悌.血液病診斷與療效標(biāo)準(zhǔn)［M］.3版.北京：北京出版社，2007：103－121.

［2］ Bene MC，Castoldi G，Knappe W，et al.Proposal for the elassification of acute leukemias，European Group for the immnological characterization of leukemias（EGIL）［J］.Leukemia，1995，9（10）：1783－1786.

［3］ 王建中.臨床流式細(xì)胞分析［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2005：281.

［4］ El－Sissy AH，El－Mashari MA，Bassuni WY，et al.Aberrant lymphoid antigen experession in acute myeloid leukemia in Saudi Arabia［J］.J Egypt Natl Canc Inst，2006，18（3）：244.

［5］ Sarraf P，F(xiàn)rederich RC，Turner EM，et al.Multipile cytokines and acute inflammation raise mouseleption levels：potential role in inflammatory anorexia［J］.J Exp Med，1997，85（1）：171－175

［6］ 陶德定，舒丹，李方和，等.流式細(xì)胞術(shù)用于混合型白血病及急性未分化型白血病的診斷［J］.同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000，29（1）：21－22.