錢三立，李冰玉，吳君怡，張真中，楊春杰，鄒云增*

1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院，上海 200032;2 上海市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071

丹參來源于唇形科鼠尾草屬植物Salvia miltiorrhiza 的干燥根及根莖。丹參水溶性組分，包括丹參素、丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸等，是丹參主要的活性化合物［1］。丹參素是丹參中重要的水溶性活性組分，其他水溶性化合物都可以看作是丹參素的衍生物或者聚合物。丹參素具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、保肝的藥理活性，可用于心腦血管疾病、肝病、糖尿病并發(fā)癥、腎病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療［2-4］。

眾多研究報(bào)道了丹參素衍生物的制備方法［5］，期望能夠找到活性更強(qiáng)、口服利用率更高的化合物。由于酚羥基是丹參素抗氧化作用的活性基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)修飾主要集中在其醇羥基和羧基上進(jìn)行，羧基酯化反應(yīng)是其中重要的一種。丹參素在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物丹參素異丙酯，即3-(3，4-二羥苯基)-2-羥基丙酸異丙酯，在體外實(shí)驗(yàn)中證明具有擴(kuò)張血管的作用［6］。崔慶彬等研究了丹參素醇羥基結(jié)構(gòu)修飾對其活性的影響，結(jié)果顯示醇羥基的修飾，不能明顯增加丹參素的活性［7］。

丹參素在丹參中含量較低，常規(guī)的制備方法是采用堿處理丹參水提取物，使丹參的丹參素聚合物(如丹酚酸B、紫草酸等)在堿性條件下水解，得到丹參素粗品，后者經(jīng)過進(jìn)一步純化制得丹參素純品。然而，丹參素在堿性條件下不穩(wěn)定，并且純化得到的丹參素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后，需要再一次純化其產(chǎn)物，這無疑大大增加了生產(chǎn)成本。丹參中主要水溶性成分丹酚酸B、紫草酸和迷迭香酸，是丹參素多聚體，在丹參中含量較高。如果能夠開發(fā)一條工藝，將丹參素多聚體的解聚和衍生化合并一步完成，直接制備丹參素的衍生物，將顯著降低其生產(chǎn)成本。本研究探討了用丹參水提取物一步制備成丹參素乙酯的工藝，具有生產(chǎn)應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

丹參藥材，產(chǎn)自山東臨沂，購自安徽亳州藥材市場，經(jīng)過上海醫(yī)藥工業(yè)研究院王曙光博士鑒定確證。乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、硫酸，皆為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑廠。色譜級乙腈、甲醇為美國天地(Tedia)品牌。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼［1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical;2，2-Diphenyl-1-(2，4，6-trinitrophenyl)hydrazyl)，DPPH］，購自Sigma。丹參提取物對照品丹酚酸B(批號:13091231)、紫草酸(批號:12082915)、迷迭香酸(批號:14011215)、丹參素(批號:13121106)購自上海同田生物技術(shù)有限公司。

1.2 丹參提取物的制備

丹參藥材加入10 倍量70%乙醇，80 ℃提取兩次，每次1 h，提取液過濾合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，剩余部分調(diào)節(jié)至pH 7，兩倍體積的乙酸乙酯萃取兩次，去除其中的脂溶性成分丹參酮。剩余水相，調(diào)節(jié)至pH 2，兩倍體積的乙酸乙酯萃取兩次，乙酸乙酯相濃縮至干，得到的浸膏即為水提取物，可以直接作為合成用原料(其中丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸三者含量應(yīng)該不低于85%，以上述三者計(jì)算的收率應(yīng)該不低于90%)。

1.3 丹參素乙酯制備

10 g 丹參水提取物溶解在200 mL 無水乙醇中，加入濃硫酸200 μL，水浴加熱，保持乙醇回流，HPLC 檢測反應(yīng)進(jìn)程，6 h 后終止反應(yīng)。

調(diào)節(jié)反應(yīng)液至pH 2，濃縮回收乙醇，剩余部分，加入200 mL 水溶解，調(diào)節(jié)至pH 6，過大孔吸附樹脂“微球1 號”，水洗脫，分步收集50 mL/瓶，HPLC 檢測。產(chǎn)物純度超過80% 的樣品合并，濃縮至200 mL，調(diào)節(jié)pH 6，再次過樹脂，最終得到純度超過98%的樣品，冷凍干燥，用于下一步的光譜學(xué)分析，結(jié)構(gòu)鑒定。由于丹參素乙酯水溶性較強(qiáng)，該純化過程收率較低，約30%左右。

1.4 DPPH 自由基清除試驗(yàn)

丹參素、丹參素乙酯清除自由基能力實(shí)驗(yàn)，通過穩(wěn)定自由基DPPH 來檢測［8］。取96 孔板，每孔加入10 μL DPPH(無水乙醇溶液，1mM)，89.6 μL 無水乙醇和0.4 μL 丹參素(或丹參素乙酯)，混勻后置于黑暗中靜置30 min，517 nm 處檢測吸光值。自由基清除能力，以IC50來計(jì)算，表示清除半數(shù)自由基所需要的丹參素(或丹參素乙酯)的濃度。

1.5 HPLC 分析方法

丹參水溶性組分的提取、丹參素乙酯的制備、純化等，都通過HPLC 檢測。HPLC 采用安捷倫HP1200 液相色譜儀，配備四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測器。流動(dòng)相為1.7%甲酸∶乙腈∶水=75∶23∶2，流速1 mL/min，檢測波長286 nm。采用C18液相色譜柱，柱溫25 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 丹參提取物一步法制備丹參素乙酯反應(yīng)過程的HPLC 圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of S.miltiorrhiza extract in the transformation to ethyl 3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoate

如圖1 所示，隨著時(shí)間的延長，HPLC 保留時(shí)間6.5 min 處出現(xiàn)產(chǎn)物并逐漸增加。紫外吸收圖譜表明，該產(chǎn)物具有和丹參素相似的吸收峰，顯示該化合物可能是丹參素的衍生物。ESI-MS 顯示其分子量為226，等同于丹參素乙酯化產(chǎn)物的分子量。由于該反應(yīng)體系采用乙醇作為溶劑，可以猜測該化合物可能是丹參素乙酯(3-(3，4-二羥苯基)-2-羥基丙酸乙酯)。NMR 結(jié)果驗(yàn)證了該化合物的結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖2 丹參素乙酯的NMR 數(shù)據(jù)Fig.2 NMR data of ethyl 3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoate

2.2 丹參提取物一步法直接制備丹參素乙酯

隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，丹參素乙酯含量逐漸增加，反應(yīng)體系中丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸含量逐漸降低，顯示丹參素乙酯可能來源于它們。同時(shí)生成保留時(shí)間7.5 min 的產(chǎn)物(原紫草酸，prolithospermic acid，參考文獻(xiàn)的方法制備［9］)，來源于丹酚酸B在酸性條件下的水解。原紫草酸在該條件下不穩(wěn)定，逐漸進(jìn)一步降解生成其他物質(zhì)。

圖3 反應(yīng)路線圖Fig.3 Chemical reaction routes

整個(gè)體系反應(yīng)過程如圖3 所示，丹參水溶性組分中丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸在濃硫酸的催化下發(fā)生水解，生成丹參素，后者在乙醇體系內(nèi)發(fā)生酯化丹參素乙酯。由于羧酸和醇的酯化反應(yīng)一般采用相似的反應(yīng)條件，可以預(yù)見若采用其它醇類化合物，亦會(huì)發(fā)生類似的酯化反應(yīng)，得到相關(guān)醇的酯化產(chǎn)物。采用類似的方法，可以直接由丹參水溶性提取物，制備各種丹參素酯化產(chǎn)物。相比傳統(tǒng)的首先提純丹參素然后酯化反應(yīng)的方法，本工藝采用硫酸做催化劑，并且省略了丹參素純化的過程。由于丹參素在酸性條件下更加穩(wěn)定，本方法得率更高，為我們提供了一種制備丹參素酯化產(chǎn)物的新方法。

2.3 丹參主要化合物及丹參素乙酯清除自由基試驗(yàn)

自由基主要包括超氧陰離子自由基、羥基自由基、脂氧自由基、羧自由基等，是機(jī)體氧化反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)，具有強(qiáng)氧化性，可以對機(jī)體健康細(xì)胞產(chǎn)生巨大的損害，引起慢性疾病及衰老癥狀［10，11］。丹參水溶性組分，包括丹參素、丹酚酸B 等，具有非常強(qiáng)的清除自由基的能力?；衔锟寡趸钚缘拇笮?，常用其清除自由基能力的大小來檢測。DPPH 是一種穩(wěn)定自由基，其溶液在517 nm 波長下有較大吸收，當(dāng)該自由基被其它化合物所清除時(shí)在該波長下吸收減弱，因此常采用它來測定化合物對自由基的清除能力［8］。

圖4 丹酚酸B、紫草酸、丹參素和丹參素乙酯對自由基的清除能力對比Fig.4 DPPH scavenging ability of salvianolic acid B，lithospermic acid，danshensu and ethyl 3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoate

圖4 顯示丹參主要水溶性化合物丹酚酸B、紫草酸、丹參素和丹參素乙酯自由基清除能力，他們的IC50分別為:5.15、6.40、10.25、9.68 μg/mL。丹酚酸B、紫草酸的自由基清除能力強(qiáng)于丹參素，丹參素被乙酯化后，其自由基清除能力略有增加，差異達(dá)到顯著水平(P＜0.01)。

乙酯化后，丹參素的自由基清除能力增加，同時(shí)乙酯化后導(dǎo)致丹參素脂水分配系數(shù)的改變，使其更容易透過細(xì)胞膜進(jìn)入體內(nèi)，從而可以明顯增加其口服吸收率。

丹參素是丹參中主要的活性組分之一，雖然其活性低于丹酚酸B，但由于其分子量更小，且更容易被純化，使其化合物的結(jié)構(gòu)修飾成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。

由于通過化學(xué)合成的丹參素是光學(xué)混旋體，目前丹參素的大量制備方法仍然以丹參水提取物水解為主。本研究將丹參水提取物的水解和衍生化在一個(gè)體系內(nèi)通過一步反應(yīng)完成，同時(shí)水解催化采用濃硫酸而非堿，水解后的產(chǎn)物進(jìn)一步酯化得到了丹參素衍生物，從而保證了水解反應(yīng)進(jìn)行完全，且反應(yīng)原料和產(chǎn)物未接觸強(qiáng)堿從而降低了副反應(yīng)，增加了反應(yīng)的收率(以丹酚酸B 計(jì)算，本反應(yīng)總收率超過40%)?？梢灶A(yù)見，本實(shí)驗(yàn)采用的思路，可以推廣至其他丹參素酯化物的制備，為我們提供了一種簡單、高效、低成本的制備方法。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)介紹了一種通過丹參水提物直接制備丹參素乙酯的方法。同已有的報(bào)道相比，本研究省略了丹參素制備、純化的過程，直接將丹參水提物水解成丹參素和丹參素的酯化反應(yīng)合并到一步反應(yīng)進(jìn)行，使反應(yīng)過程變得更加簡單。由于酯化反應(yīng)具有類似的反應(yīng)條件，因此丹參素其他酯化衍生物的制備，也可以借鑒本研究使用的方法。

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