張業(yè)奇，鄧鯤華，楊 怡，王玉婷，王 詩，丁 虹*

1武漢大學(xué)藥學(xué)院，武漢 430072;2 湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，咸寧 437100

乳香為橄欖科植物卡氏乳香樹(Boswellia carterii Birdw)及同屬其它數(shù)種植物皮部切傷后滲出的油膠樹脂。中藥乳香基源植物是乳香樹，產(chǎn)自索馬里和埃塞俄比亞。乳香于《名醫(yī)別錄》、《本草拾遺》和《本草綱目》均有記載并沿用至今，認(rèn)為其辛散溫通，具有活血行氣等功效，廣泛用于風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的治療［1］。乳香的主要有效成分有揮發(fā)油，其中含有醋酸辛酯和芳樟醇等物質(zhì)，天然的芳樟醇?xì)馕都冋?、圓和，甜潤、幽雅，具有安神鎮(zhèn)靜的作用［2］。有文獻(xiàn)表明，乳香精油(Frankincense)芳香療法和灸法綜合應(yīng)用于治療抑郁癥(Depression)的臨床療效同鹽酸氟西汀相近［3］。但是單一使用乳香精油治療抑郁癥尚未見報道，并且其抗抑郁的機(jī)制并不清楚。本實驗通過觀察單一使用乳香精油對慢性不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁小鼠行為學(xué)及大腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT 的影響，探究乳香精油抗抑郁的作用并初步探究其抗抑郁機(jī)理，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品與試劑

鹽酸氟西汀(批號2079A，禮來蘇州制藥有限公司)，純?nèi)橄憔?江西億森源香料有限公司，水蒸氣蒸餾法萃取)，5-HT 標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma 公司)，鹽酸、乙酸鈉等其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

搖床，烘箱(上海申光儀器表有限公司)，小鼠行為觀察敞箱，1/100 秒表，HPLC-ECD(日本島津LC-10Avp plus)。

1.1.3 實驗動物

1.2 方法

1.2.1 抑郁模型造模及給藥

參照文獻(xiàn)方法［4］，采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激抑郁模型(chronic unpredictable mild stress，CUMS):將小鼠予以夾尾(1 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、45 ℃熱烘(5 min)、晝夜顛倒(24 h)、4 ℃冰水游泳(5 min)、水平振蕩(30 min)等方法隨機(jī)刺激21 d，除空白組外其它組每日給予1 種刺激。小鼠隨機(jī)分為5 組，每組12 只，分別為:空白組、模型組、氟西汀(2 mg/kg)組、低劑量(0.1 mL/100 g)乳香精油組，高劑量(0.2 mL/100 g)乳香精油組。每組按小鼠體重1 mL/100 g 進(jìn)行灌胃(其中乳香精油組以豆油稀釋后灌胃)，空白組及模型組灌服等量生理鹽水，造模同時即開始給藥，每日1 次，連續(xù)21 d。

1.2.2 行為學(xué)實驗

行為學(xué)實驗共進(jìn)行三次，分別在實驗第7 d、實驗第14 d 和實驗第21 d 進(jìn)行。

1.2.2.1 曠場實驗

末次給藥60 min 后進(jìn)行，敞箱高40 cm，長和寬均為100 cm，敞箱底面劃分為面積相等的25 塊方格。小鼠放入敞箱中央1 min 后再記錄小鼠5 min內(nèi)的行為學(xué)表現(xiàn)包括其水平方向移動格數(shù)和垂直方向直立(兩前肢離地1 cm 以上)次數(shù)［5］。

1.2.2.2 懸尾實驗

曠場實驗完成60 min 后，在距尾尖1 cm 處固定小鼠尾端，使其呈倒掛懸空狀，頭部離箱底5 cm，四周以板隔離小鼠視線。記錄小鼠6 min 內(nèi)后5 min 的懸尾不動時間［6］。

1.2.2.3 強(qiáng)迫游泳實驗

懸尾實驗完成60 min 后，將小鼠頭部朝下放入直徑16 cm、水深18 cm 的游泳杯中，水溫20±2 ℃，記錄小鼠6 min 內(nèi)后5 min 的游泳不動時間［6］。

1.2.3 腦組織勻漿樣本制備及5-HT 的測定

實驗第22 d，解剖小鼠，將剪取的大腦置于液氮中速凍待測。從液氮中取出大腦稱重，根據(jù)大腦重量，加入其重量4 倍數(shù)值體積的0.1 M 過氯酸(含0.3 M EDTA 和0.5 mM 亞硫酸鈉)，于冰浴下用勻漿機(jī)快速勻漿。在4 ℃下14000 rpm 離心15 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm 針頭過濾器過濾［7］。采用高效液相色譜-電化學(xué)檢測器系統(tǒng)(HPLC-ECD)進(jìn)行測定，色譜條件為:色譜柱為4 mm ×250 mm，Novapak C18，5 μm(武漢大學(xué)實驗中心提供);流動相為15 mM 鹽酸-乙酸鈉緩沖液，pH 4.0(內(nèi)含0.5%三乙胺和0.5 mM EDTA 二鈉)，流速0.6 mL/min。

1.2.4 統(tǒng)計方法

2 實驗結(jié)果

2.1 乳香精油對曠場實驗中小鼠水平方向移動格數(shù)的影響

與空白組比較，模型組小鼠水平方向移動格數(shù)顯著降低(P＜0.05)。與模型組比較，實驗第7、14d，氟西汀組、低劑量乳香精油組和高劑量乳香精油組小鼠水平方向移動格數(shù)均顯著增加(P＜0.05)，實驗第21 d，這三組小鼠水平方向移動格數(shù)明顯增加，分別增加了157.5%、108.0%、177.4%。

表1 乳香精油對曠場實驗中小鼠水平方向移動格數(shù)的影響(，n=12)Table 1 Effect of frankincense on the frequency of horizontal movement in open-field test (，n=12)

表1 乳香精油對曠場實驗中小鼠水平方向移動格數(shù)的影響(，n=12)Table 1 Effect of frankincense on the frequency of horizontal movement in open-field test (，n=12)

注:與模型組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與空白組比較，△P＜0.05，ΔΔP＜0.01。Note:Compared with model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;compare with blank group，△P＜0.05，ΔΔP＜0.01.

2.2 乳香精油對曠場實驗中小鼠垂直方向豎直次數(shù)的影響

與空白組比較，第7、14 d 模型組小鼠垂直方向豎直次數(shù)顯著降低(P＜0.05)。與模型組比較，第7、14 d 氟西汀組、低劑量乳香精油組、高劑量乳香精油組小鼠垂直方向豎直次數(shù)均顯著提高(P＜0.05)。

2.3 乳香精油對小鼠懸尾不動時間的影響

與空白組比較，模型組小鼠懸尾不動時間顯著增加(P＜0.05)。與模型組比較，第7、14 d 氟西汀、低劑量乳香精油組和高劑量乳香精油組小鼠懸尾不動時間均顯著減少(P＜0.05)，實驗第21 d，這三組小鼠的懸尾不動時間分別縮短了67.8%、65.1%、62.8%。

表2 乳香精油對曠場實驗中小鼠垂直方向豎直次數(shù)的影響(，n=12)Table 2 Effect of frankincense on the frequency of vertical movement in open-field test (，n=12)

表2 乳香精油對曠場實驗中小鼠垂直方向豎直次數(shù)的影響(，n=12)Table 2 Effect of frankincense on the frequency of vertical movement in open-field test (，n=12)

注:與模型組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與空白組比較，△P＜0.05。Note:Compared with model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;compare with blank group，△P＜0.05.

表3 乳香精油對小鼠懸尾不動時間的影響(，n=12)Table 3 Effect of frankincense on the time of tail suspending test (，n=12)

表3 乳香精油對小鼠懸尾不動時間的影響(，n=12)Table 3 Effect of frankincense on the time of tail suspending test (，n=12)

注:與模型組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與空白組比較，△P＜0.05。Note:Compared with model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;compare with blank group，△P＜0.05.

表4 乳香精油對小鼠游泳不動時間的影響(，n=12)Table 4 Effect of frankincense on the time of forced swimming test (，n=12)

表4 乳香精油對小鼠游泳不動時間的影響(，n=12)Table 4 Effect of frankincense on the time of forced swimming test (，n=12)

注:與模型組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與空白組比較，△P＜0.05，ΔΔP＜0.01。Note:Compared with model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;compare with blank group，△P＜0.05，ΔΔP＜0.01.

2.4 乳香精油對小鼠游泳不動時間的影響

與空白組比較，模型組小鼠游泳不動時間顯著增加(P＜0.05)。與模型組比較，氟西汀組、低劑量乳香精油組和高劑量乳香精油組小鼠游泳不動時間顯著減少(P＜0.05)，實驗第21 d，這三組小鼠游泳不動時間分別縮短了99.2%、36.5%、24.9%。

2.5 乳香精油對小鼠大腦內(nèi)5-HT 的影響

與空白組比較，模型組小鼠大腦內(nèi)5-HT 含量顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，氟西汀組、低劑量乳香精油組和高劑量乳香精油組小鼠大腦內(nèi)5-HT 含量均顯著升高(P＜0.05)，分別升高了81.4%、52.7%、37.2%。

表5 乳香精油對慢性應(yīng)激模型小鼠腦內(nèi)5-HT 的影響(，n=12，ng/g)Table 5 Effect of frankincense on the contents of 5-HT in brain of CUMS model mice (，n=12，ng/g)

表5 乳香精油對慢性應(yīng)激模型小鼠腦內(nèi)5-HT 的影響(，n=12，ng/g)Table 5 Effect of frankincense on the contents of 5-HT in brain of CUMS model mice (，n=12，ng/g)

注:與模型組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;與空白組比較，ΔΔP＜0.01。Note:Compared with model group，* P＜0.05，＊＊P＜0.01;compare with blank group，ΔΔP＜0.01.

3 討論

本研究運用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激方法，建立經(jīng)典小鼠抑郁癥模型，經(jīng)曠場實驗、懸尾實驗、強(qiáng)迫游泳實驗對小鼠進(jìn)行行為學(xué)評測，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠明顯出現(xiàn)抑郁癥狀，證實該模型建立成功。與模型組比較，氟西汀組和低劑量乳香精油組小鼠在曠場實驗、懸尾實驗和強(qiáng)迫游泳實驗中均有明顯的行為改善(P＜0.05)，高劑量乳香精油組小鼠也有一定的行為改善，證明單一使用乳香精油也能起到一定的抗抑郁作用。

在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制研究中，腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)，如5-HT、去甲腎上腺素和多巴胺等功能不足的發(fā)病機(jī)制，早已得到普遍公認(rèn)［8］。但是，對于精油類天然產(chǎn)物如乳香精油的抗抑郁作用機(jī)制并無定論。本實驗中，氟西汀組和乳香精油組小鼠均有不同程度的行為改善，并且在化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)方面，小鼠大腦內(nèi)的5-HT 含量均明顯升高(P＜0.05)，表明乳香精油對大腦內(nèi)的單胺神經(jīng)遞質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用，揭示了乳香精油抗抑郁作用的一種重要機(jī)制。

乳香精油作為藥食兩用的天然產(chǎn)物，又具有良好的抗抑郁作用。本實驗探索了精油灌胃的給藥方式，為乳香精油類抗抑郁保健品或藥品的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，有望降低現(xiàn)行抗抑郁藥物如氟西汀等對肝和腎的毒副作用。

1 Chang YP(常允平)，Han YM(韓英梅)，Zhang JY(張俊艷).Research advance on chemical constituents and pharmacological action of Boswellia carterii.Drugs Clin (現(xiàn)代藥物與臨床)，2012，1(27):52-59.

2 Liu HL(劉洪玲).GC-MS of essential oil in Frankincense.Lishizhen Med Mater Med Res(時珍國醫(yī)國藥)，2009，20:370-371.

3 Liu Y(劉瑤)，Qiao Y(喬瑜)，Li L(李玲)，et al.Aromatherapy with moxibustion treatment of depression in clinical research.Pract Tradit Chin Med(實用中醫(yī)藥雜志)，2009，25:213-214.

4 Willner P，Towell A，Sampson D，et al.Reduction of sucrose preference by chronic unpredictable mild stress，and its restoration by a tricyclic antidepressant.Phychopharm，1987，93:358-364.

5 Kennett GA，Dickinson SL，Curzon G.Enhancement of some 5-HT-dependent behavioural responses following repeated immobilization in rats.Brain Res，1985，330:253-263.

6 Xiong JY(熊靜悅)，Zeng N(曾南)，Zhang CY(張崇燕)，et al.Antidepressant effect of Xiaoyaosan.Pharmocol Clin Chin Mater Med(中藥藥理與臨床)，2007，23:3-5.

7 Tang YM(唐亞梅)，Chen CM(陳春梅)，Liu Y(劉勇).Concentration change of DA，5-HT and their metabolites in brain tissue of depression models rat treated with chronic unpredicted mild stress.Hunan Normal Univ，Med Sci(湖南師范大學(xué)學(xué)報，醫(yī)學(xué)版)，2012，9(3):57-64.

8 Racagni G，Brunello N.Physiology to functionality:The brain and neurotransmitter activity.Int Clin Psychopharmacol，1999，14:3-7.