于 力，王津津，史秀杰，鄭曉聰，賈 鵬，蘭文升，劉 葒

（深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045）

鯉科皰疹病毒2型 Taqman實(shí)時(shí)熒光PCR方法的建立

于 力，王津津，史秀杰，鄭曉聰，賈 鵬，蘭文升，劉 葒

（深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045）

本研究針對(duì)鯉科皰疹病毒2型（CyHV-2）的主要衣殼蛋白基因，設(shè)計(jì)了特異性引物和Taqman探針，建立了實(shí)時(shí)熒光PCR方法。其檢測(cè)下限為83拷貝，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)R2＞0.998，且經(jīng)比對(duì)，靈敏度與現(xiàn)行方法相當(dāng)。選取了健康異育銀鯽、金魚(yú)、鯉魚(yú)以及常見(jiàn)4種水生DNA病毒以及7種水生環(huán)境細(xì)菌進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均無(wú)交叉反應(yīng)。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)顯示，2份獨(dú)立的15次重復(fù)結(jié)果變異系數(shù)均小于2%，說(shuō)明本方法重復(fù)性好。本方法能作為目前CyHV-2疫病檢測(cè)方法的有效補(bǔ)充，對(duì)該病的防控具有重要的意義。

CyHV-2；實(shí)時(shí)熒光PCR；Taqman；異育銀鯽；金魚(yú)

鯉科皰疹病毒2型（CyHV-2）是從鯉科魚(yú)類(lèi)分離的第二種皰疹病毒。CyHV-2的核衣殼呈六角形或球形，直徑為100～110nm，有囊膜的病毒粒子呈橢圓形，直徑為175～200nm[1]。該病毒對(duì)金魚(yú)和鯽魚(yú)有很高的致病性，死亡率幾乎可達(dá)100%。在日本、美國(guó)、澳大利亞、英國(guó)和中國(guó)都發(fā)生過(guò)該病發(fā)生[2-8]，對(duì)觀賞魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大沖擊，引起經(jīng)濟(jì)損失。目前還沒(méi)有針對(duì)CyHV-2的疫苗，因此及早的診斷對(duì)防控本病非常重要。

細(xì)胞分離技術(shù)是重要的檢測(cè)方法。錦鯉鰭細(xì)胞KF-1，金魚(yú)鰭細(xì)胞GFF等細(xì)胞系雖能產(chǎn)生細(xì)胞病變，但隨著病毒代數(shù)的增加，病變逐漸不明顯，甚至消失[9-10]。分子生物學(xué)檢測(cè)方法是應(yīng)用廣泛的方法，也是最靈敏的方法，目前現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法主要有普通PCR[6]以及實(shí)時(shí)熒光PCR[11]，分別針對(duì)病毒的解旋酶和DNA聚合酶基因。本研究針對(duì)CyHV-2的主要衣殼蛋白MCP基因，設(shè)計(jì)了Taqman熒光PCR引物，建立了實(shí)時(shí)熒光PCR方法，具有良好的靈敏度、特異性與重復(fù)性。

1 材料與方法

1.1 樣品、病毒和細(xì)菌

感染CyHV-2的異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）樣品于2011年9月從我國(guó)中部地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)收集而來(lái)，水溫21–25℃；健康異育銀鯽、金魚(yú)（Carassius auratus auratus）和鯉魚(yú)（Cyprinus Carpio）樣品來(lái)自我國(guó)中部地區(qū)，經(jīng)現(xiàn)有方法[6，11]檢測(cè)為CyHV-2陰性。

流行性造血器官壞死病毒（EHNV）澳大利亞參考株由澳大利亞動(dòng)物衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。錦鯉皰疹病毒（KHV）20100202、甲魚(yú)虹彩病毒（STIV）9701、真鯛虹彩病毒（RSIV）20140706由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus（IAM1011）購(gòu)自東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所（IAM）；嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophilia（ATCC19570）、單增李斯特氏菌Listeria monocytogenes（ATCC13932）購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌株保藏中心（ATCC）；溫和氣單胞菌A. sobria（20010836）、陰溝腸桿菌Enterobacter cloacae（20010243）、副溶血弧菌Vibrio Parahemolyticus（20090853）、創(chuàng)傷弧菌V. vulni ficus（20080191）由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank上的CyHV-2序列基因，對(duì)比分析后選取保守區(qū)域MCP基因ORF92（Genbank ID：14011329）設(shè)計(jì)引物。使用軟件Oligo 7設(shè)計(jì)出熒光PCR引物和探針，其產(chǎn)物大小為100bp'。

正向引物MCP-rtF：5'-AAGCGATCCCGAGACTCTTG-3'，

反向引物MCP-rtR：5'-TATTGCATGATGCGGGTGAA-3'，

探 針 MCP-rtP：5'-FAM-CTGCTGACCGATCCATGCGGC-BHQ1-3'。

同時(shí)，針對(duì)熒光PCR擴(kuò)增位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了普通PCR引物以制備陽(yáng)性質(zhì)粒，擴(kuò)增產(chǎn)物為477bp。

MCP-F：5'-AAACTCATCTGCACCGAGTCCC-3'，

MCP-R：5'-CCAAGACCATCTGACGGTGCT-3'。

所有引物探針均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3 DNA提取

將從病魚(yú)、健康異育銀鯽、金魚(yú)和鯉魚(yú)采集的腦、脾與腎混合勻漿后進(jìn)行核酸抽提。本實(shí)驗(yàn)用到的組織與病毒懸液均使用QIAamp DNA Mini QIA-cube Kit進(jìn)行DNA提取。細(xì)菌則涂布平板后挑取單菌落，用ddH2O重懸至濁度達(dá)到1.0麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)，100℃水浴加熱10min，12000rpm離心10min，取上清液作為核酸模板。

1.4 實(shí)時(shí)熒光PCR

使用Platinum qPCR Super-mix UDG（Life Technology）試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明配制反應(yīng)體系，引物終濃度為400nM，探針終濃度為200nM，程序?yàn)椋?0℃ 2min，95℃ 2min，40個(gè)循環(huán)（95℃ 15s，60℃ 45s）。使用ABI 7500 real time PCR system進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。

1.5 MCP基因目標(biāo)片段質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)1.2使用普通PCR引物，擴(kuò)增出477bp產(chǎn)物。將普通PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的大小亮帶，使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（Takara）試劑盒回收。連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂布到含氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單克隆，經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性質(zhì)粒攜帶菌株后，用含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，使用MiniBEST Plasmid Puri fication Kit（Takara）試劑盒純化質(zhì)粒，PCR鑒定并送華大基因測(cè)序。確定目標(biāo)片段成功插入后，用分光光度計(jì)測(cè)定核酸含量，并根據(jù)質(zhì)粒的分子量計(jì)算質(zhì)粒濃度。

1.6 特異性試驗(yàn)

將KHV、STIV、EHNV、RSIV、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、陰溝腸桿菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、單增李斯特氏菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)，并設(shè)置陰性對(duì)照健康異育銀鯽、金魚(yú)與鯉魚(yú)組織核酸和空白對(duì)照。

1.7 靈敏性試驗(yàn)

將純化好的質(zhì)粒按照10倍梯度稀釋?zhuān)M(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏性實(shí)驗(yàn)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。同時(shí)，取適量病魚(yú)組織提取病毒核酸，用分光光度計(jì)測(cè)定含量，再按照10倍梯度稀釋?zhuān)瑢F(xiàn)行熒光PCR方法[11]與本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)MCP方法的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行比較。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

選取2份獨(dú)立的CyHV-2陽(yáng)性組織樣品核酸（命名為CyHV-2A和CyHV-2B），分別進(jìn)行15次重復(fù)實(shí)時(shí)熒光PCR。選取健康的異育銀鯽、金魚(yú)和鯉魚(yú)核酸樣品各1份，分別進(jìn)行5次重復(fù)實(shí)時(shí)熒光PCR。統(tǒng)計(jì)其Ct值平均值，標(biāo)準(zhǔn)差以及變異系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 特異性試驗(yàn)

實(shí)時(shí)熒光PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，用感染CyHV-2異育銀鯽提取的DNA有典型S型擴(kuò)增，而陰性對(duì)照健康異育銀鯽、金魚(yú)和鯉魚(yú)組織DNA，空白對(duì)照，以及KHV、STIV、EHNV、RSIV、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、陰溝腸桿菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、單增李斯特氏菌均未見(jiàn)有擴(kuò)增，可見(jiàn)上述方法特異性良好。

圖1 實(shí)時(shí)熒光PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 靈敏性試驗(yàn)

構(gòu)建MCP基因目標(biāo)片段質(zhì)粒，將純化好的質(zhì)粒作10倍梯度稀釋?zhuān)≠|(zhì)?？截悢?shù)8.3×107-8.3×101拷貝的梯度，進(jìn)行熒光PCR。結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)下限為8.3×101拷貝（圖2），標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)R2＞0.998（圖3），說(shuō)明擬合直線(xiàn)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)高度一致。將現(xiàn)行熒光PCR方法[11]與本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)MCP方法的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行比較，試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)MCP方法在每個(gè)病毒核酸量梯度的標(biāo)準(zhǔn)差均小于現(xiàn)行方法，說(shuō)明本MCP方法結(jié)果比較穩(wěn)定，且在2.845×10-4ng病毒核酸梯度時(shí)，本MCP方法3個(gè)平行均檢出，而現(xiàn)行方法僅有1個(gè)孔檢出。

圖2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)下限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

表1 本試驗(yàn)設(shè)計(jì)MCP方法與現(xiàn)行熒光PCR方法[11]的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行比較

表2實(shí)時(shí)熒光PCR重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

陰性樣品健康異育銀鯽、金魚(yú)和鯉魚(yú)核酸的所有平行均為未檢出，陽(yáng)性樣品結(jié)果見(jiàn)表2，2份陽(yáng)性組織樣品的標(biāo)準(zhǔn)差小于0.3，變異系數(shù)小于2%。

3 討論

主要衣殼蛋白MCP是皰疹病毒的重要結(jié)構(gòu)，參與病毒復(fù)制過(guò)程，且高度保守[12]。因此本試驗(yàn)選取MCP基因ORF92，設(shè)計(jì)了實(shí)時(shí)熒光PCR。經(jīng)過(guò)一系列篩選與優(yōu)化，最終確定了1組實(shí)時(shí)熒光PCR引物。實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)下限為83拷貝，與現(xiàn)行熒光PCR方法[11]屬于同一個(gè)數(shù)量級(jí)。使用從陽(yáng)性組織樣品中提取的核酸進(jìn)行兩種方法的比對(duì)，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)MCP方法對(duì)于低核酸含量樣品具有更理想的檢出率，同時(shí)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差也比較小，穩(wěn)定性較好。實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)R2＞0.998，說(shuō)明擬合直線(xiàn)與試驗(yàn)數(shù)據(jù)高度一致。

本試驗(yàn)選擇健康異育銀鯽、金魚(yú)和鯉魚(yú)組織，常見(jiàn)的4種水生DNA病毒以及7種水生環(huán)境細(xì)菌進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。異育銀鯽和金魚(yú)是CyHV-2最主要的宿主[1，12]，而鯉魚(yú)是鯉科魚(yú)類(lèi)的重要成員。在4種水生DNA病毒中，KHV是鯉皰疹病毒3型（CyHV-3），與CyHV-2基因相近[12-14]。7種水生環(huán)境細(xì)菌都是水生環(huán)境中較為常見(jiàn)的細(xì)菌，由于采樣時(shí)常常會(huì)帶有池水及其水體環(huán)境中的細(xì)菌，且熒光PCR較為靈敏，因此比較容易干擾試驗(yàn)結(jié)果。而特異性試驗(yàn)結(jié)果均無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明該實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性理想。

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果中，2份獨(dú)立的15次重復(fù)結(jié)果變異系數(shù)均小于2%，說(shuō)明本方法重復(fù)性理想[15]。而 3份陰性樣品重復(fù)試驗(yàn)，也驗(yàn)證了本方法的特異性。

Goodwin等所建立的現(xiàn)行熒光PCR[11]，針對(duì)DNA聚合酶基因。而本試驗(yàn)針對(duì)的是MCP基因，這能與現(xiàn)行方法形成很好的補(bǔ)充，結(jié)合使用能提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。同時(shí)，本試驗(yàn)在靈敏性和特異性檢驗(yàn)方面做得更全面。首先，在靈敏性試驗(yàn)中，Goodwin等的文章使用的是目標(biāo)基因的質(zhì)粒，與實(shí)際檢測(cè)情況會(huì)有差別，因?yàn)檫€會(huì)含有宿主、病毒全基因組等影響因素，本試驗(yàn)同時(shí)使用質(zhì)粒和陽(yáng)性組織進(jìn)行靈敏性計(jì)算，結(jié)果會(huì)更加全面。其次，在特異性試驗(yàn)中，本試驗(yàn)使用了3種鯉科魚(yú)、4種DNA病毒和7種水生細(xì)菌的核酸進(jìn)行驗(yàn)證，而Goodwin等的文章僅使用了鯉皰疹病毒的其他型。

本研究的不足是在于沒(méi)有使用鯉皰疹病毒1型（CyHV-1）進(jìn)行特異性試驗(yàn)，但相信這不會(huì)對(duì)實(shí)際檢測(cè)造成影響，原因如下：（1）CyHV-1主要感染鯉魚(yú)，而CyHV-2主要感染金魚(yú)和鯽魚(yú)[12]，因此檢測(cè)金魚(yú)和鯽魚(yú)時(shí)不太可能受CyHV-1的干擾；（2）CyHV-1的臨床癥狀明顯，主要在體表和鰭條出現(xiàn)腫瘤狀病變[16]，而CyHV-2無(wú)此典型癥狀；（3）將熒光PCR引物探針序列在NCBI BLAST上進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果未見(jiàn)有CyHV-1，說(shuō)明引物與CyHV-1序列不匹配，出現(xiàn)交叉反應(yīng)的可能性很小。

綜上所述，本研究建立了針對(duì)CyHV-2的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，具備良好的靈敏度、特異性和重復(fù)性。本方法能作為目前CyHV-2疫病檢測(cè)方法的有效補(bǔ)充，對(duì)該病的防控具有重要意義。

Establishment of Taqman Real-time PCR for Cyprinid Herpesvirus 2

Yu Li，Wang Jinjin，Shi Xiujie，Zheng Xiaocong，Jia Peng，Lan Wensheng，Liu Hong
（Shenzhen Exit-entry Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong 518045）

Primers and Taqman probe targeting major capsid protein of cyprinid herpesvirus 2（CyHV-2）were designed and a real-time PCR method was established. The lower limit of detection was 83 copies，and standard curve R2＞0.998.Comparison experiments showed that the sensitivity of this method was of same level as existing method. HealthyCarassius auratus gibelio，Carassius auratus auratus，Cyprinus Carpio，4 aquatic viruses and 7 aquatic bacteria were included for specificity tests，no cross reaction was observed. Repeatability tests showed that both coefficients of variation of independent result repeated 15 times were smaller than 2%，suggesting that the repeatability of this method was ideal. The established method would be supplementary to the existing CyHV-2 detection methods，and was of important significance for disease control.

CyHV-2；real-time PCR；Taqman；Carassius auratus gibelio；Carassius auratus auratus

S851.34

A

1005-944X（2015）10-0080-05

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013IK043和2014IK236）

劉 葒

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胡藕祥）