李明勇，宋大偉，王志全

（1.青島康大生物科技有限公司，山東青島 266400；2.青島市黃島畜牧局海青動(dòng)檢站，山東青島 266415）

青島市兔源產(chǎn)ESBL大腸桿菌的耐藥性及多重耐藥調(diào)控基因SoxS序列的分析

李明勇1，宋大偉1，王志全2

（1.青島康大生物科技有限公司，山東青島 266400；2.青島市黃島畜牧局海青動(dòng)檢站，山東青島 266415）

[目的]了解兔源產(chǎn)ESBL大腸桿菌耐藥特點(diǎn)，為掌握其造成的耐藥性危害提供數(shù)據(jù)參考。[方法]2015年3-4月從青島4個(gè)養(yǎng)兔場(chǎng)采集118份兔糞便棉拭子，進(jìn)行大腸桿菌分離，并檢測(cè)對(duì)16種抗生素的耐藥譜，及對(duì)多重耐藥調(diào)控基因SoxS攜帶率。[結(jié)果]從118份兔糞便棉拭子分離獲得68株大腸桿菌，確證篩選出47株產(chǎn)ESBL大腸桿菌，占兔源大腸桿菌的69.1%。藥敏結(jié)果顯示所有產(chǎn)ESBL大腸桿菌菌株耐藥性較強(qiáng)且呈現(xiàn)多重耐藥，僅對(duì)碳青霉烯類藥物敏感率100%。兔源產(chǎn)ESBL大腸桿菌多重耐藥調(diào)控基SoxS攜帶率為100%，且不同動(dòng)物源性產(chǎn)ESBL大腸桿菌的多重耐藥調(diào)控基因同源關(guān)系較近。[結(jié)論]青島地區(qū)兔源產(chǎn)ESBL 大腸桿菌分離率高且耐藥譜廣，多重耐藥調(diào)控基因SoxS攜帶率高，主要涉及到細(xì)菌主動(dòng)外排泵出機(jī)制，使得大腸桿菌對(duì)抗生素的敏感性中起到了至關(guān)重要的作用，本研究對(duì)抗生素在臨床中的應(yīng)用起指導(dǎo)意義。

兔源；大腸桿菌；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）；SoxS基因；多重耐藥性

1 引言

隨著臨床上大量抗生素的使用和濫用，造成越來(lái)越多的大腸桿菌開始出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，使臨床上抗感染治療更加困難。而產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamases，ESBLs） 是 其多重耐藥的主要機(jī)制之一[1]。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶能水解第一、第二、第三代頭孢菌素（如頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松）及單氨類抗生素（如氨曲南）[2]。產(chǎn)ESBL大腸桿菌呈現(xiàn)多重耐藥的耐藥機(jī)制多涉及到主動(dòng)外排泵出機(jī)制，可引起細(xì)菌對(duì)多種抗生素高頻率、高水平耐藥[3]。AcrAB-TolC外排系統(tǒng)是大腸桿菌最主要的主動(dòng)外排系統(tǒng)，是細(xì)菌增加抗生物外排的一種主要途徑，可排除多種抗生素[4-7]。外排系統(tǒng)表達(dá)水平受多種調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，如AcrR、MarA、MppA、RobA和SoxS等，其中SoxS引起的TolC、AcrAB、micF和rimK基因的激活改變了大腸桿菌對(duì)一系列抗生素的敏感性，從而使得耐藥菌株的出現(xiàn)率增加[8-10]。

大腸桿菌病對(duì)兔的危害表現(xiàn)在造成1月齡內(nèi)仔兔腹瀉，采食量降低。因此，了解兔源產(chǎn)ESBL大腸桿菌株的耐藥譜，及多重耐藥調(diào)控基因SoxS的序列攜帶情況，對(duì)臨床上合理利用抗菌藥物、增強(qiáng)抗感染治療效果意義重大。

2 材料

2.1 病料

2015年3月- 4月從山東青島某四個(gè)兔場(chǎng)采集仔兔的肛門棉拭子118份。

2.2 主要試劑

伊紅美藍(lán)瓊脂、麥康凱瓊脂、Mueller-Hintion瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

2.3 藥敏片

頭孢他啶（30μg/片）、頭孢他啶/棒酸（10μg/片）、頭孢噻肟（30μg/片）、頭孢噻肟/棒酸（10μg/片）、復(fù)方新諾明（25μg/片）、氨芐西林（10μg/片）、氯霉素（30μg/片）、鏈霉素（10μg/片）、卡那霉素（30μg/片）、慶大霉素（10μg/片）、氟苯尼考（30μg/片）、萘啶酸（30μg/片）、阿莫西林（20μg/片）、頭孢噻吩（30μg/片）、諾氟沙星（10μg/片）、氨曲南（30μg/片）、環(huán)丙沙星（5μg/片）、四環(huán)素（30μg/片）均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，使用時(shí)所有藥敏紙片均在有效期內(nèi)。

3 方法

3.1 樣品稀釋與大腸桿菌分離

500μL的生理鹽水稀釋兔糞便棉拭子，混勻后，用接種于含有頭孢噻肟的伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h。挑取伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上具黑色中心有金屬光澤或無(wú)光澤的典型單個(gè)菌落，接種于麥康凱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h。挑取麥康凱培養(yǎng)基上的粉紅色單個(gè)菌落，LB液體增菌培養(yǎng)37℃ 12～16h。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 16S rRNA PCR鑒定大腸桿菌

通用大腸桿菌16S rRNA引物，上游F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'， 下 游 R：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'[11]。按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取DNA。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

3.3 產(chǎn)ESBL大腸桿菌的確證及藥敏實(shí)驗(yàn)

菌液調(diào)至0.5McFarland濁度，用滅菌的棉拭子均勻涂布于M-H培養(yǎng)基上。平板上同時(shí)貼放頭孢他啶、頭孢他啶/棒酸、頭孢噻肟、頭孢噻肟/棒酸，37℃，18～24h。根據(jù)CLSI2009標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)產(chǎn)ESBL菌株表型確證判定。檢測(cè)產(chǎn)ESBL陽(yáng)性菌株對(duì)其余14種抗生素的敏感性。

3.4 重耐藥調(diào)控基因SoxS的檢測(cè)與克隆

根據(jù)已發(fā)表文章中大腸桿菌的 SoxS 基因序列的上游引物 F為：5'-CGGGGTACCATGTCCCATCAGAAAAT-3'；下游引物R為：5'-GCATCTAGATTACAGGCGGTGGC-3'，上、下游引物分別含有KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)[12]。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性：95℃ 5min；變性：95℃ 30s，退火：38℃ 45s，延伸：72℃ 60s，30 Cycles；延伸：72℃ 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定?；厥漳康腄NA基因，將目的片段與pMDl8-T載體連接 16℃ 30min，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。質(zhì)粒PCR鑒定為陽(yáng)性測(cè)序。

3.5 多重耐藥調(diào)控基因Soxs序列測(cè)定及進(jìn)化分析

通過(guò)將序列在NCBI上對(duì)比找出四株同源性較高的菌株SoxS序列和本實(shí)驗(yàn)室保存的雞源序列，利用MEGA5.1軟件進(jìn)行分析。

4 結(jié)果

4.1 大腸桿菌的分離鑒定

對(duì)118份兔糞便棉拭子初分離的大腸桿菌進(jìn)行16S rRNA保守區(qū)域基因的擴(kuò)增，獲得68株大腸桿菌。目的條帶大約在1524bp，并且測(cè)序結(jié)果與NCBI中大腸桿菌16S rRNA的保守區(qū)域一致（圖1）。

圖1 產(chǎn)ESBL大腸桿菌16S rRNA PCR擴(kuò)增

4.2 產(chǎn)ESBL大腸桿菌的耐藥譜

經(jīng)產(chǎn)ESBL確證實(shí)驗(yàn)確定，獲得47株產(chǎn)ESBL大腸桿菌，分離率為69.1%。由藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）可知，所有產(chǎn)ESBL的大腸桿菌呈現(xiàn)多重耐藥性，對(duì)大多數(shù)抗生素耐藥。特別是對(duì)青霉素類和第一、三代頭孢菌素類抗生素，如對(duì)氨芐西林、頭孢噻吩、頭孢噻肟的耐藥率達(dá)100%。所有菌株對(duì)其他種類抗生素的耐藥性同樣非常高，耐藥率在68.1%～97.8%之間。僅對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物（亞胺培南、美羅培南）均表現(xiàn)100%敏感。

圖2 產(chǎn)ESBL大腸桿菌耐藥率柱狀圖

4.3 多重耐藥調(diào)控基因SoxS的攜帶情況

在47株產(chǎn)ESBL大腸桿菌中均攜帶SoxS基因，攜帶率為100%（圖3）。

圖3 部分菌株多重耐藥調(diào)控基因SoxS擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

4.4 多重耐藥調(diào)控基因SoxS基因序列分析

同一兔場(chǎng)（ZC2）中產(chǎn)ESBL大腸桿菌菌株SoxS基因序列同源性均為100%，僅選擇一株進(jìn)行序列分析。由圖4與表1可知，兔場(chǎng)1和兔場(chǎng)3分離產(chǎn)ESBL大腸桿菌菌株（ZC1和ZC3）的多重耐藥調(diào)控基因SoxS的序列親緣關(guān)系為100%。兔場(chǎng)2分離的產(chǎn)ESBL大腸桿菌菌株（ZC2）的SoxS序列親緣關(guān)系和實(shí)驗(yàn)室保存的兔源產(chǎn)ESBL大腸桿菌菌株（JC）的也較近，為99.1%。同時(shí)，ZC1菌株和JC菌株的SoxS基因親緣關(guān)系為98.8%。SoxS基因核苷酸序列比較可以看出核苷酸位點(diǎn)變化率低，其中ZC2和JC菌株的52位氨基酸發(fā)生相同突變（Ala-Thr）。

圖4 不同菌株SoxS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 大腸桿菌SoxS基因核苷酸序列比較分析

5 討論

產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的菌株1983年被Klieb C首次報(bào)道后，在患者、畜牧和環(huán)境中不斷檢出，且這類菌株的耐藥譜廣，其造成的感染會(huì)給臨床治療帶來(lái)極大的困難。本次實(shí)驗(yàn)在118份兔糞便棉拭子中，分離篩選47株產(chǎn)ESBL大腸桿菌，分離率高。由此可見，產(chǎn)ESBL大腸桿菌在兔場(chǎng)中已普遍存在。兔源產(chǎn)ESBL大腸桿菌對(duì)多種抗生素耐藥率都非常高。青霉素類和頭孢菌素類都屬于β-內(nèi)酰胺類，這些藥物均是超廣譜β-內(nèi)酰胺酶所能作用水解的。同時(shí)，對(duì)磺胺類和四環(huán)素類也表現(xiàn)出高耐藥性，耐藥率高達(dá)95% 。氨基糖苷類、喹諾酮類和氟喹諾酮類耐藥率都在75%以上，所以這三類藥物用于治療大腸桿菌病的效果不佳。但所有菌株都對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物表現(xiàn)敏感，這是因?yàn)槲覈?guó)禁止獸醫(yī)臨床應(yīng)用碳青霉烯類抗菌藥物。

兔源產(chǎn)ESBL大腸桿菌對(duì)多重耐藥調(diào)控基因SoxS攜帶率高，其主要與耐藥機(jī)制的外排系統(tǒng)有關(guān)，可調(diào)控相關(guān)耐藥基因的激活，改變大腸桿菌對(duì)抗生素的敏感性，使耐藥菌株增加。從不同菌株SoxS序列分析來(lái)看，兔場(chǎng)內(nèi)部和兔場(chǎng)之間的產(chǎn)ESBL大腸桿菌多重耐藥調(diào)控基因SoxS序列親緣關(guān)系都非常近，核苷酸和氨基酸的位點(diǎn)變化率低。與實(shí)驗(yàn)室保存雞源、人源大腸桿菌中SoxS基因序列的同源性高，核苷酸變化位點(diǎn)相同，因此SoxS基因的核苷酸與氨基酸序列變化可能與動(dòng)物源性無(wú)關(guān)[12-13]。不同物種來(lái)源的SoxS序列關(guān)系相似，這說(shuō)明不同動(dòng)物源性該調(diào)控基因的可能存在互相傳播，這種機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

總之，青島地區(qū)兔源產(chǎn)ESBL大腸桿菌存在率非常高，且對(duì)多種抗生素具有耐藥性，多重耐藥調(diào)控基因SoxS攜帶率高。這是由于抗菌藥物的濫用，已造成此類菌株形成臨床感染治療上、抗生素的選擇將受到更大的限制[15]。所以嚴(yán)肅用藥原則，是控制或延緩細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要環(huán)節(jié)；同時(shí)需要嚴(yán)格控制兔場(chǎng)的養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生，加強(qiáng)對(duì)兔場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境的監(jiān)控，凈化兔場(chǎng)水源和空氣，為防止耐藥菌株通過(guò)水源和空氣傳播提供強(qiáng)有力的保障。

Analysis of Antibiotic Susceptibility and Multidrug Resistant SoxS Gene of ESBL-producing Escherichia coli strains from Rabbit

Li Mingyong1，Song Dawei1，Wang Zhiquan2
（1.Qingdao Kangda Bioscience Company Ltd，Huangdao，Qingdao，Shandong 266400；
2. Haiqing Animal Quarantine Station，Huangdao Animal Husbandry Bureau，Qingdao，Shandong 266415）

[Objective]To understand the antimicrobial characteristics of ESBL-producingE. colistrains from rabbits and provide important data for reference to know their antimicrobial hazard.[Methods]118 rabbit fecal samples were taken from 4 rabbit farms in Qingdao region forE. coliisolation and anti-microbial identification.[Results]68E. colistrains were isolated from the 118 rabbit fecal samples with 47 ESBL-producingE. colistrains，all of which were multi-drug resistant but sensitive to carbapenems. Polymerase chain reaction and cloning of the SoxS gene demonstrated that the multi-drug resistant SoxS gene carrying rate of ESBL-producingE. colistrains from rabbit was 100%.[Conclusion]The isolation rate of ESBL-producingE. colistrains from Qingdao region was high with wide drug resistance spectrum. High rate of multi-drug resistant SoxS gene was mainly involved in the bacterial ef fl ux pump mechanism，playing key role in sensitivity ofE. colito antibiotics. The study provided guidance for clinical application of antibiotics.

rabbit；Escherichia coli；extended-spectrum β-lactamase（ESBL）；SoxS gene；multiple antibiotic resistance

S852.61+2

A

1005-944X（2015）10-0028-04

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胡藕祥）