韋 蒙，許新恒，李俊龍，申世安，劉 靜，丁春邦

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，雅安 625014

滇重樓［Paris polyphyllavar.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.］是2010年版《中國藥典》收載的中藥材重樓的基原植物之一，為延齡草科(Trilliaceae)重樓屬(Paris)多年生草本植物，以干燥根莖入藥［1］。中醫(yī)認為重樓具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，主要用于止血、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎、抗菌抑菌、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等，已廣泛應(yīng)用于臨床［2，3］。重樓的藥用部位為根莖，主要活性成分為甾體皂苷、黃酮類和多糖類［4］。

滇重樓根莖生長緩慢，從種子發(fā)芽到生長成藥用商品，一般需要10～15年。每年秋末10～11月，地上莖葉部分會枯萎倒下并被丟棄，其生物質(zhì)的總產(chǎn)量要遠高于地下部分。據(jù)文獻報道，滇重樓莖葉含有與根莖相近的皂苷成分。因此，對滇重樓的地上莖葉部分進行開發(fā)利用，將大幅提高滇重樓的綜合利用率，在一定程度上也可緩解重樓藥材的供需矛盾，增加藥農(nóng)收入，推動滇重樓人工種植的發(fā)展［5，6］。

目前植物皂苷的提取方法主要有溶劑提取法、生物酶解提取法、微波輔助提取法和超聲波輔助提取法等［7-10］，其中，超聲波輔助提取法是利用超聲波能提高有效成分提取率的一種技術(shù)，具有低消耗、高效率、操作簡便和節(jié)約時間的優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中有效成分的提?。?1，12］。因此，本實驗利用響應(yīng)面法(response surface methodology，RSM)優(yōu)化滇重樓莖葉中總皂苷的超聲波輔助提取工藝，并分析所得總皂苷的抗氧化活性，為滇重樓莖葉的有效利用和開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滇重樓莖葉，2013年10月采自云南省文山州重樓種植基地，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)丁春邦教授鑒定為滇重樓［Paris polyphyllavar.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.］。晾干后粉碎常溫保存。

石油醚(60～90 ℃)、甲醇、2，2-二苯基-1-苦味基肼(DPPH)、薯蕷皂苷元標準品、丙酮、水楊酸、鄰苯三酚、鹽酸、硫酸亞鐵等。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SHB-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予化儀器廠)，UV-1750 型紫外分光光度計(Shimadzu，日本)，F(xiàn)A2004B 型電子天平(上海精天電子儀器有限公司)，UPT-T-101 型超純水器(成都超純水科技有限公司)，DZTW 型調(diào)溫?zé)崽?、FW135 型高速萬能粉碎機以及DZKW-S-6 型電熱恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器廠)，RE-2000B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，7D-4Z 型臺式低速離心機(蜀科儀器有限公司)，KQ-300DV 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 滇重樓莖葉總皂苷的提取工藝流程

晾干的滇重樓莖葉經(jīng)粉碎過篩，依次用石油醚和丙酮除去色素。稱取樣品粉末10.0 g，置于錐形瓶中，超聲輔助提取一定時間。提取液離心取上清液，檢測總皂苷含量。提取液濃縮蒸發(fā)得到總皂苷浸膏。所得浸膏經(jīng)大孔樹脂分離純化后真空干燥，得到總皂苷樣品。

1.3.2 滇重樓莖葉總皂苷含量的測定

參考王俊等的方法［13］。取滇重樓莖葉總皂苷提取液0.5 mL，揮干溶劑，加入5%的冰醋酸-香草醛溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL。搖勻后30 ℃條件下反應(yīng)30 min，加入冰醋酸5 mL 終止反應(yīng)。410 nm處測定吸光度。以薯蕷皂苷作標準品，標準曲線為Y=7.2901X+0.054，R2=0.9954，表明在0～0.5 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

總皂苷得率(%)=樣品液中總皂苷濃度×樣品液體積/滇重樓莖葉粉末質(zhì)量×100%

1.3.3 單因素試驗

以滇重樓莖葉中總皂苷得率為指標，研究料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL，固定提取溫度55 ℃，超聲功率210 W，提取時間1.5 h)、提取溫度(40、45、50、55、60 ℃，固定料液比1∶15，超聲功率210 W，提取時間1.5 h)、提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，固定料液比1∶15，提取溫度55 ℃，超聲功率210 W)、超聲功率(150、180、210、240、270 W，固定料液比1∶15，提取溫度55 ℃，提取時間1.5 h)對總皂苷得率的影響。試驗3 次重復(fù)。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理，選擇超聲功率(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)和料液比(D)4 個因素為自變量，以滇重樓莖葉總皂苷得率為響應(yīng)值(R)，設(shè)計四因素五水平響應(yīng)面試驗(表1)，預(yù)測滇重樓莖葉總皂苷超聲輔助提取的最佳工藝。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.5 滇重樓莖葉總皂苷的抗氧化活性測定

1.3.5.1 DPPH 自由基清除能力的測定

參考Liu 等［14］的實驗方法，適當改進。用乙醇配制0.2 mmol/L 的DPPH 溶液，用甲醇配制一系列梯度的總皂苷溶液。向具塞試管中加入2 mL DPPH和2 mL 不同濃度的總皂苷溶液，混勻，黑暗條件下常溫反應(yīng)30 min，517 nm 測定吸光值。試驗3 次重復(fù)。

式中，A1為加入樣品的反應(yīng)液吸光值，A0為用甲醇代替樣品的反應(yīng)液吸光值。

1.3.5.2 羥自由基清除能力的測定

參考Saeed 的實驗方法［15］，適當改進。向具塞試管內(nèi)按順序加入9 mmol/L FeSO41 mL，9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL，加入總皂苷溶液2 mL，最后加入8.8 mmol/LH2O22 mL 啟動反應(yīng)，37 ℃下反應(yīng)0.5 h，510 nm 測定吸光值。試驗3 次重復(fù)。

式中，A1為加入樣品的反應(yīng)液吸光值，A0為用甲醇代替樣品的反應(yīng)液吸光值。

1.3.5.3 超氧陰離子清除能力的測定

參考Chen 等［16］的實驗方法，適當改進。向具塞試管內(nèi)加0.05 mol/L pH 8.2 Tris-HCl 緩沖液5 mL，在25 ℃條件下預(yù)熱5 min，加1 mL 總皂苷溶液，25 ℃反應(yīng)20 min 后，加入0.4 mL 3 mmol/L 的鄰苯三酚，混勻，25 ℃反應(yīng)5 min，用0.5 mL 的濃鹽酸終止反應(yīng)，299 nm 測定吸光值。試驗3 次重復(fù)。

式中，A1為加入樣品的反應(yīng)液吸光值，A0為用Tris-HCl 緩沖液代替樣品的反應(yīng)液吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 超聲功率對滇重樓莖葉總皂苷得率的影響

如圖1A 所示，總皂苷得率隨超聲功率增加而增加，當功率達240 W 時，總皂苷得率為2.84%，表明超聲功率240 W 時，原料中總皂苷已基本萃取到溶液中。考慮到節(jié)約能源與保護設(shè)備，故選擇超聲功率240 W。

2.1.2 提取溫度對滇重樓莖葉總皂苷得率的影響

如圖1B 所示，總皂苷得率隨提取溫度的上升而快速增加，當溫度到達55 ℃后，總皂苷得率基本穩(wěn)定，此時總皂苷得率為2.13%。表明55 ℃時，提取溶劑已很好地穿透滇重樓莖葉細胞。為減少溶劑揮發(fā)和節(jié)約能源成本，故選取最佳提取溫度為55℃。

2.1.3 提取時間對滇重樓莖葉總皂苷得率的影響

如圖1C 所示，隨提取時間的增加，總皂苷得率迅速增加，當提取時間達2 h 時，總皂苷得率為2.38%，之后延長時間，總皂苷得率基本穩(wěn)定。表明提取時間2 h 已能將原料中總皂苷基本溶出。為縮短提取周期、節(jié)約成本，故選取最佳提取時間為2 h。

2.1.4 料液比對滇重樓莖葉總皂苷得率的影響

由圖1D 可知，隨著料液比的增加，總皂苷得率不斷增加，在料液比為1∶15(g/mL)時，總皂苷得率達到最大值2.12%，之后基本穩(wěn)定。料液比為1∶15(g/mL)時，材料中的總皂苷基本溶出，繼續(xù)增大溶劑量，其總皂苷得率無明顯增加?？紤]到節(jié)省溶劑成本，故選擇最優(yōu)料液比為1∶15(g/mL)。

圖1 超聲功率(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)和料液比(D)對滇重樓莖葉總皂苷得率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic power (A)，extraction temperature (B)，extraction time (C)，solid-liquid ratio (D)on the extraction yield of total saponins

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化滇重樓莖葉總皂苷的提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

利用Design-Expert 7.0 軟件對表2 中的試驗結(jié)果進行二次多元回歸擬合，得到滇重樓莖葉總皂苷得率(R)與超聲功率(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)和料液比(D)之間的回歸模型為:

表2 Box-Behnken 中心組合設(shè)計方案及實驗結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and the results of these experiments

2.2.2 回歸模型方差分析與顯著性檢驗

利用Design-Expert 7.0 軟件對回歸模型進行方差分析(analysis of variance，ANOVA)(表3)，結(jié)果顯示，模型極顯著(P＜0.01)，失擬項不顯著(P＞0.05);R2=0.9143，說明該模型擬合度較好。因此該模型可以用于預(yù)測滇重樓莖葉總皂苷超聲波輔助提取的最佳工藝。

各因素對滇重樓總皂苷得率顯著性分析可以看出，顯著性最強的是提取溫度和提取時間，其次是超聲功率，而料液比對總皂苷得率的影響不顯著。因素間交互效應(yīng)中，AB、BC 和BD 的交互效應(yīng)顯著。四個因素的二次項效應(yīng)均顯著。根據(jù)F值大小，可以得出各因素對滇重樓總皂苷得率的影響大小為提取時間＞提取溫度＞超聲功率＞料液比。

表3 回歸模型方差分析Table 3 The variance analysis of regression model

圖2 各因素間交互作用對總皂苷得率影響的響應(yīng)面圖［R=f(A，B)(A)、R=f(A，C)(B)、R=f(A，D)(C)、R=f(C，B)(D)、R=f(D，B)(E)、R=f(D，C)(F)］Fig.2 Response surface plots showing the effects of different variables on extraction yield of total saponins

2.2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程，繪制總皂苷得率(R)和試驗因素超聲功率(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)和料液比(D)的響應(yīng)面圖(圖2)。在其他因素條件固定不變的情況下，考察交互項之間的影響。根據(jù)圖2的響應(yīng)面與等高線變化規(guī)律可以看出，隨著各因素值的增大，響應(yīng)值R 逐漸升高;當R 值達到極值之后，隨著各因素量的增大，響應(yīng)值R 逐漸減小。比較各圖可知，提取溫度和超聲功率的拋物線最陡(圖2A)，提取時間和料液比的拋物線(圖2F)則較為平緩，與方差分析結(jié)果一致。等高線越密，表明因素對總皂苷得率的影響越大。從圖2 可以看出，提取溫度較提取功率對總皂苷得率的影響大(圖2A);提取溫度較提取時間對總皂苷得率的影響大(圖2D);提取溫度較料液比的影響大(圖2E);提取時間較料液比的影響大(圖2F)，這與方差分析結(jié)果一致。

2.2.4 最佳工藝參數(shù)與驗證試驗

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化，超聲輔助提取滇重樓莖葉總皂苷的最佳工藝參數(shù)為料液比1∶12.30(g/mL)、提取溫度53.72 ℃、超聲功率215.92 W、提取時間1.90 h。在此工藝條件下，滇重樓莖葉總皂苷得率的預(yù)測值為2.385%。

考慮到實際可操作性，將最佳工藝參數(shù)調(diào)整為料液比1∶12(g/mL)、提取溫度54 ℃、超聲功率210 W、提取時間2 h，在此條件下進行3 次重復(fù)驗證試驗，滇重樓莖葉總皂苷平均得率為2.360%，與預(yù)測值的相對誤差為1.04%，表明該模型能用于指導(dǎo)超聲輔助提取滇重樓莖葉總皂苷的提取工藝，具有實用價值。

2.3 滇重樓莖葉總皂苷的抗氧化活性分析

自由基擁有很高的反應(yīng)活性，在生物體內(nèi)能氧化細胞膜、變性蛋白質(zhì)、甚至破壞DNA，進而損傷細胞和器官，甚至誘發(fā)多種慢性疾病危害健康，如動脈硬化、糖尿病和某些腫瘤等［17］。因此，需要抗氧化劑來清除多余的活性氧自由基以防止機體遭受氧化傷害。研究表明，皂苷具有抗氧化等多種生物活性［3］。

由圖3 可知，在低濃度范圍內(nèi)，總皂苷溶液對自由基的清除率與樣品濃度有明顯的量效關(guān)系，清除率隨濃度增加而增加;高濃度時，清除率趨于平緩。在6 mg/mL 時，總皂苷對DPPH 自由基清除率達98%，其IC50值為2.223 mg/mL。表明滇重樓莖葉總皂苷溶液具有很強的DPPH 自由基清除能力(圖3A)。如圖3B、C 所示，總皂苷對羥自由基和超氧陰離子清除活性較其對DPPH 的清除活性弱。在8 mg/mL 時，總皂苷對羥自由基和超氧陰離子的清除活性分別是58% 和64%，其IC50值分別為6.782 mg/mL 和4.638 mg/mL。表明滇重樓莖葉總皂苷溶液對羥自由基和超氧陰離子具有一定的清除能力。

圖3 總皂苷對DPPH(A)、羥自由基(B)和超氧陰離子(C)的清除能力Fig.3 DPPH (A)，hydroxyl (B)and superoxide (B)radical scavenging activities of total saponins

3 結(jié)論

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到超聲輔助提取滇重樓莖葉總皂苷的最佳工藝條件為料液比1∶12(g/mL)、提取溫度54 ℃、超聲功率210 W、提取時間2 h，在此條件下進行3 次重復(fù)驗證試驗，滇重樓莖葉總皂苷平均得率為2.360%，與預(yù)測值的相對誤差為1.04%。說明此優(yōu)化工藝參數(shù)可靠，具有實用價值。

體外抗氧化試驗結(jié)果表明，滇重樓莖葉總皂苷對DPPH 自由基、羥自由基和超氧陰離子均有較明顯的清除效果，最大清除率分別為98%、58% 和64%，其IC50分別為2.223 mg/mL，6.782 mg/mL 和4.638 mg/mL。因此，滇重樓莖葉總皂苷具有較好的抗氧化活性。

1 China Pharmacopoeia Committee(國家藥典委員會).Pharmacopoeia of People's Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:Chinese Medical Science and Technology Press，2010:243-244.

2 Hong Y(洪燕)，Han YQ(韓燕全)，Liu XG (劉向國)，et al.Quality control ofPairsroot and advancement on pharmacological study.J Shanxi Coll Tradit Chin Med(山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報)，2014，14:66-69.

3 He HJ(何含杰)，Zhang HY(章懷云)，Chen LL(陳麗莉)，et al.Polyphyllin pharmacological effects and clinical applications of research progress.J Chin Med Mater(中藥材)，2014，37:527-530.

4 Wu SS(武珊珊)，Gao WY(高文遠)，Duan HQ(段宏泉)，et al.Advances in studies on chemical constituents and pharmacological activities ofRhizoma Paridis.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2004，35:344-347.

5 Zeng WM(曾衛(wèi)民)，Zhao TZ(趙庭周).Analysis on utilization of stem and leaves growing on the ground ofParis polyphyallvar.yunnanensis.Chin Agric Sci Bull(中國農(nóng)學(xué)通報)，2012，28:266-270.

6 Pu W(卜偉)，Zhao J(趙君)，Shen ZQ(沈志強).Comparison of hemostatic，analgesic and anti-inflammatory effects of total saponins between the aerial and underground parts ofParis polyphyllavar.yunnanensis.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2009，21:370-372.

7 Lin HC(林海成)，Zhu HY(祝洪艷)，He ZM(何忠梅)，et al.Optimization of extraction technology for total saponins fromZiziphi spinoseasemen by orthogonal test.Chin J Exp Tradit Med Form(中國實驗方劑學(xué)雜志)，2014，21:22-25.

8 Zhao Y(趙巖)，Yu T(于婷)，Jin DM(金達明)，et al.Enzymatic extraction of ginsenosides.Shanghai J Tradit Chin Med(上海中醫(yī)藥雜志)，2014，48:103-113.

9 Ouyang LN(歐陽麗娜)，Li LL(李蘭林)，Wu X(吳雪)，et al.Saponins microwave extraction process orthogonal designPanax japonicus.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2010，41:1639-1642.

10 Gao X(高俠)，Li YX(黎云祥)，Cai LY(蔡凌云)，et al.Ultrasonic-assisted solvent extraction of total saponins fromAcanthopanan trifoliatusleaves.Food Sci(食品科學(xué))，2009，30:69-72.

11 Pang TC(龐庭才)，Hu SY(胡上英)，Zhong QP(鐘秋平)，et al.Response surface optimization of ultrasound-assisted extraction of flavonoids from nutshell ofHeritiera littoralisDryand.J Chin Med Mater(中藥材)，2014，37:2290-2294.

12 Xie XJ(謝小俊)，Lin LZ(林樂珍)，Zheng GD(鄭國棟).Extraction technology of polyphenols fromSmilax chinaL.by ultrasonic method.Food Sci Technol(食品科技)，2014，39:231-234.

13 Wang J(王俊)，Yang KD(楊克迪)，Chen J(陳鈞).Determination of diosgenin by spectrophotometry.Anal Lab(分析試驗室)，2004，23:73-75.

14 Liu F，Liu WH，Tian SG.Artificial neural network optimization ofAlthaea roseaseeds polysaccharides and its antioxidant activity.Int J Biol Macromole，2014，70:100-107.

15 Saeed T.Optimization of polysaccharides fromZagros oakleaf using RSM:Antioxidant and antimicrobial activities.Carbohydr Polym，2014，106:238-246.

16 Chen JJ，Zhang T，Jiang B.Characterization and antioxidant activity ofGinkgo bilobaexocarp polysaccharides.Carbohydr Polym，2012，87:40-45.

17 Maritim AC，Sanders RA，Watkins JB.Diabetes，oxidative stress，and antioxidants:a review.J Biochem Mole Toxicol，2003，17:24-38.