陳 彤，王常青，方 甜，白云云，寧慶鵬

山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006

沙棘又名醋柳，是一種藥食同源植物，沙棘果中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，在我國“三北”地區(qū)分布廣泛。脫脂沙棘籽是沙棘榨油后的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量豐富［1］。經(jīng)測定，脫脂沙棘籽中含有25%～30%的蛋白質(zhì)，如果能夠?qū)⑦@些蛋白質(zhì)充分利用，酶解加工成小分子活性多肽，不僅可以提高蛋白的消化吸收率，還可能具有一定的保健作用［2］。長期過量飲酒或一次性大量飲酒會(huì)導(dǎo)致乙醇脫氫酶(ADH)活性降低，使人體對乙醇的代謝功能下降，進(jìn)而加重乙醇對腦、肝臟等器官的危害作用［3］。有研究表明，具有ADH 激活作用的物質(zhì)可以促進(jìn)肝臟對乙醇的分解和代謝，從而起到醒酒作用。例如大豆肽、玉米肽等多肽產(chǎn)品可激活體外及小鼠肝臟乙醇脫氧酶的活性，加速乙醇的代謝，以達(dá)到醒酒的目的，且多肽相比傳統(tǒng)解酒藥屬天然產(chǎn)品，具有吸收迅速發(fā)揮效果快的優(yōu)點(diǎn)［4，5］。

目前，國內(nèi)外對于沙棘黃酮及多糖的護(hù)肝作用研究較多［6］，但對沙棘籽蛋白及多肽的研究很少，尚未見到用酶解沙棘籽制備醒酒活性肽的研究。本實(shí)驗(yàn)采用木瓜蛋白酶水解沙棘籽制備活性多肽，該方法工藝簡單，且得到的多肽對ADH 具有較高的激活率，是一種潛在的醒酒多肽，為開發(fā)新型醒酒產(chǎn)品提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂沙棘籽為二氧化碳超臨界提油后的殘?jiān)?，粗蛋白含?6.25%，山西五臺(tái)山沙棘制品有限公司提供。菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶，廣西龐博生物工程有限公司;ADH(300 U/mg)、氧化性輔酶I，上海源聚生物科技有限公司;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Sephadex 凝膠色譜系統(tǒng)、UVD-680-3 紫外檢測儀，上海金達(dá)生物科技有限公司;UV-2600 型紫外-可見分光光度計(jì)，尤尼科(上海)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申升科技有限公司;卷式超濾-納濾膜組件，北京安德膜分離技術(shù)工程有限公司;其它儀器為常規(guī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 沙棘籽渣酶解物的制備

脫脂沙棘籽經(jīng)粉碎、過篩和去雜后，按料液比1∶ 15(m/V)加水浸泡過夜，離心取上清液，得到沙棘籽蛋白粗提液。在粗提液中分別加入菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和無花果蛋白酶，以相同的酶活比在各蛋白酶適宜條件下酶解3 h，滅酶離心后取上清液，濃縮至多肽濃度為1.5%后備用。通過測定不同蛋白酶酶解液對ADH 的激活率，比較并篩選出對ADH 激活率最高的多肽及相應(yīng)蛋白酶［7］。

1.3.2 蛋白酶酶解液及多肽對ADH 活性的研究方法

將不同樣液微濾后，采用瓦勒-霍赫法測定沙棘籽酶解液對ADH 活性的激活率［8］。

ADH 活力(E)計(jì)算公式為:

式中:E——酶的活力(U);E340——340 nm 處每分鐘吸光值的增大值;Ew——每毫升所用酶液中含酶量(mg/mL);6.2——NADH 的克分子吸光值系數(shù);3.2——反應(yīng)液的總體積(mL);U——在規(guī)定條件下每分鐘還原l μmol NAD+時(shí)所需酶量。

式中:A——酶活力激活率(%);E樣品——樣品反應(yīng)液的酶活力(U);E空白——空白反應(yīng)液的酶活力(U)。

1.3.3 沙棘籽酶解多肽的工藝條件優(yōu)化

以ADH 激活率和多肽得率為指標(biāo)，分別進(jìn)行酶解pH 值(5、6、7、8、9)，酶解溫度(30、40、50、60、70℃)，酶解時(shí)間(1、2、3、4、5 h)和加酶量(2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g)單因素實(shí)驗(yàn)。由于本實(shí)驗(yàn)旨在制備高ADH 激活率的沙棘籽多肽，因此在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定酶解溫度、酶解時(shí)間和酶解pH 值的L9(33)正交實(shí)驗(yàn)方案(見表1)，并對正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，確定該醒酒肽的最佳制備工藝。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.4 膜分離法對沙棘籽酶解液進(jìn)行分級(jí)分離

選用截留分子質(zhì)量為8 000、3 000、2 000、500 Da 的超濾膜和納濾膜，分離得到5 種組分［9］，即分子質(zhì)量Mw ＞8 kD、Mw 在8～3 kD、Mw 在3～2 kD、Mw 在2～0.5 kD、Mw ＜0.5 kD。將5 種分離液及原酶解液分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、濃縮到相同多肽含量后備用。

1.3.5 多肽分子量及各組分含量分析

水解物中總氮量測定參照GB5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》的方法進(jìn)行;多肽含量采用GB/T 22729-2008《海洋魚低聚肽粉》中的三氯乙酸沉淀法測定;氨基酸態(tài)氮含量測定采用甲醛滴定法。

分子量的測定采用Sephadex G-25 凝膠色譜分析法，測檢波長為220 nm。Marker 為肌紅蛋白(17 000Da)、胸腺肽(3 108 Da)、桿菌酶(1 486 Da)和還原性谷胱甘肽(307 Da)。以Marker 的相對分子質(zhì)量對數(shù)(logMr)為橫坐標(biāo)，洗脫體積(Ve)為縱坐標(biāo)制作曲線方程:Ve=－35.462 logMr+212.19。用峰面積歸一法計(jì)算出不同多肽溶液中各段分子量的分布。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 制備沙棘籽渣醒酒肽的蛋白酶篩選結(jié)果

前期篩選實(shí)驗(yàn)表明，巰基蛋白酶對沙棘籽水溶性蛋白的水解物具有一定的ADH 激活率。其中，木瓜蛋白酶酶解液的ADH 激活率(30.46%)最高，菠蘿蛋白酶酶解液次之，無花果蛋白酶酶解液的ADH激活率最低。因此選用木瓜蛋白酶做為醒酒活性肽的最佳用酶，進(jìn)行下一步活性多肽最佳提取工藝的實(shí)驗(yàn)。

表2 不同巰基蛋白酶酶解沙棘籽渣蛋白粗提液效果的對比Table 2 Comparison of enzymolysis results of H.rhamnoides seed protein by different thiol proteases

2.2 木瓜蛋白酶制備沙棘籽多肽的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解溫度對沙棘籽多肽得率和ADH 激活率的影響

在加酶量4 000 U/g，酶解時(shí)間3 h，酶解pH 7.0 的條件下，隨著溫度的升高，多肽得率不斷增大，60 ℃時(shí)達(dá)到最大，超過60 ℃時(shí)，多肽得率逐漸下降。溫度過低會(huì)抑制酶的生物活性，但溫度過高超過酶的最適溫度，可能會(huì)造成酶蛋白變性，導(dǎo)致活性下降、得率降低。當(dāng)酶解溫度為50 ℃時(shí)，盡管多肽得率沒有60 ℃時(shí)高，但沙棘籽多肽的ADH 激活率最高，因此選擇酶解溫度為50 ℃。

圖1 酶解溫度對多肽得率和ADH 激活率的影響Fig.1 Effect of enzymolysis temperature on the peptide yield and ADH activation rate

2.2.2 酶解時(shí)間對沙棘籽多肽得率和ADH 激活率的影響

在以上酶解條件下，ADH 活性和多肽得率開始是隨著酶解時(shí)間的加長，不斷增大，4 h 時(shí)達(dá)到最大;但超過4 h 時(shí)，多肽得率開始下降，超過3 h 時(shí)，ADH 激活率會(huì)逐漸下降(見圖2)。這可能是隨著時(shí)間的增長，酶與底物充分反應(yīng)，多肽得率增大。但酶解時(shí)間過長，這可能會(huì)使前期酶解所得活性多肽被繼續(xù)酶解，部分具有ADH 激活作用的活性基團(tuán)遭到破壞。過長的酶解也會(huì)使部分多肽變?yōu)橛坞x氨基酸［10］。綜合考慮兩方面因素，選擇該酶的適宜酶解時(shí)間為3 h。

圖2 酶解時(shí)間對多肽得率和ADH 激活率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on the peptide yield and ADH activation rate

2.2.3 酶解pH 對沙棘籽多肽得率和ADH 激活率的影響

實(shí)驗(yàn)表明，隨著酶解pH 的升高，多肽得率不斷增大，酶解pH 為6～7 時(shí)得率最大，而ADH 激活率在pH6 時(shí)最高。當(dāng)pH ＞6 或pH ＜7 時(shí)，對ADH 激活率和多肽得率均有很大的不利影響。說明pH 過低或過高均會(huì)抑制酶的活性，可能會(huì)造成酶蛋白變性。綜合兩方面因素，選取pH 6.0 為下一步正交實(shí)驗(yàn)參數(shù)。

圖3 酶解pH 值對多肽得率和ADH 激活率的影響Fig.3 Effect of pH value on the peptide yield and ADH activation rate

2.2.4 加酶量對沙棘籽多肽得率和ADH 激活率的影響

加酶量與多肽得率及ADH 激活率的關(guān)系見圖4。隨著加酶量的不斷增加，多肽得率不斷增加，這是因?yàn)殡S著酶濃度的增加，反應(yīng)速度不斷增大。但當(dāng)酶濃度達(dá)到4000 U/g 時(shí)，再增加過量的酶多肽得率僅略有升高，而ADH 激活率則下降。這可能是由于過度水解沙棘多肽中的活性成分，破壞了前期酶解所得活性多肽。綜合前期加酶量與ADH 激活率的試驗(yàn)，最終選擇蛋白酶添加量為4000 U/g。

圖4 加酶量對多肽得率和ADH 激活率的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the peptide yield and ADH activation rate

2.3 沙棘籽渣酶解多肽制備正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)前期單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以ADH 激活率和多肽得率為指標(biāo)，進(jìn)行沙棘籽醒酒肽制備的正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Orthogonal array design and experimental results

由表3 可知，制備沙棘籽渣酶解多肽的最佳工藝組合為A3B3C2，即pH 值6.5，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間3.5 h。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，酶解多肽的ADH 激活率平均值為18.07%，高于正交表中的其他組合，證明正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠。各影響因素的主次順序?yàn)锳 ＞B ＞C，即酶解pH 對ADH 激活率的影響最大，其次是酶解時(shí)間，酶解溫度影響最小。方差分析(表4)表明，酶解pH 對酶解多肽的ADH 激活率影響顯著，酶解時(shí)間、酶解溫度兩個(gè)因素對沙棘籽渣酶解多肽的ADH 激活率影響都不顯著。正交實(shí)驗(yàn)的9 個(gè)條件的平均多肽得率為36.96%(統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)略)，在A3B3C2條件下的多肽得率為38.80%，處于較高水平，說明該條件可以兼顧到多肽得率。

2.4 不同分子質(zhì)量沙棘籽渣酶解多肽對ADH 激活

水解液經(jīng)膜分級(jí)后測得的ADH 激活率表明，3 000 Da 以上的未顯示出ADH 激活率，小于500 Da的納濾組成其ADH 活性也很低，因?yàn)楸彼?、亮氨酸等氨基酸具有醒酒作用?0］，而沙棘籽蛋白含有較豐富的丙氨酸、亮氨酸［11］，所以500 Da 納濾濾出液也具有一定的ADH 激活率(5.72%)。在500-3 000 Da 的多肽中，500-2 000 Da 的多肽組分ADH 激活率最高，為57.52%，為最主要的活性多肽;其次為2 000-3 000 Da 分子量的多肽，ADH 激活率為35.09%。

表4 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance table

表5 各級(jí)分沙棘籽渣酶解多肽的對比(+sd)Table 5 Comparison of all levels of H.rhamnoides seed polypeptide(+sd)

注:與原酶解液相比，＊＊ P ＜0.01，差異極顯著;* P ＜0.05，差異顯著。Note:Compared with enzymolysis liquid，＊＊ P ＜0.01，extremely significant difference;* P ＜0.05，significant difference.

2.5 沙棘籽渣酶解多肽的分子量分析

凝膠色譜分析和峰面積歸一法計(jì)算得知(圖5、表6)，經(jīng)超濾和納濾分級(jí)后，沙棘籽酶解濾出液中，分子量在500-2 000 Da 和2 000-3 000 Da 的質(zhì)量占到56.28%和10.22%，比未分級(jí)的原酶解液的高39.82%和3.89% ;而這兩個(gè)級(jí)分正是ADH 激活率最高的多肽組分，這兩個(gè)級(jí)分的ADH 激活率與原酶解液相比明顯提高，均可做為醒酒活性多肽開發(fā)利用。

3 結(jié)論

圖5 未經(jīng)超濾分級(jí)(A)及3 000 Da 濾出液(B)的沙棘酶解多肽的G-25 圖譜Fig.5 G-25 chromatograms of H.rhamnoides seed enzymolysis polypeptide without ultrafiltration classification(A)and 3 000 Da leaching liquid (B)

表6 沙棘酶解產(chǎn)物的主要成分及質(zhì)量含量(%)Table 6 Contents of main constituents of H.rhamnoides seeds polypeptide (%)

本實(shí)驗(yàn)表明，在三種巰基蛋白酶中，木瓜蛋白酶制備的沙棘籽多肽對ADH 的激活率最高。該酶解多肽的最佳工藝條件為:酶解pH 6.5、溫度50 ℃、時(shí)間3.5 h、加酶量4 000 U/g，此條件下ADH 激活率為18.07%，其中酶解pH 值對ADH 激活率的影響顯著。研究表明，分子量在500-2 000 Da 的酶解多肽的ADH 激活率比未分級(jí)的原酶解液極顯著提高(P＜0.01)，達(dá)到57.52%，為醒酒肽主要活性成分，其次為分子質(zhì)量在2 000-3 000 Da 的多肽ADH 激活率為35.09%。超濾與納濾分離得到的500-3 000 Da 組分質(zhì)量占水解液中多肽總質(zhì)量的66.50%，為下一步開發(fā)醒酒保健食品奠定了基礎(chǔ)。

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