原 琳，李 嬌，王有志，榮永海，榮 龍

北京航天航空大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100191

蚯蚓(Eisenia fetida)屬環(huán)節(jié)動(dòng)物門寡毛綱類單向蚓目，具有水解碳水化合物和蛋白質(zhì)的能力，可消化土壤中的落葉、褐藻、真菌等［1］。目前，對蚯蚓的研究主要集中在其與土壤的相互作用方面［2-4］，而蚯蚓體內(nèi)所含有的多種抗氧化酶未被充分開發(fā)利用。本實(shí)驗(yàn)室已完成了蚯蚓過氧化氫酶、超氧化物歧化酶以及谷胱甘肽過氧化物酶的分離提取研究［5，6］，此外，蚯蚓中還含有大量的谷胱甘肽還原酶。

谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase GR∶EC 1.6.4.2)是一種重要的黃素蛋白酶，廣泛存在于動(dòng)、植物以及微生物中。GR 的分子量為60～65 kDa，等電點(diǎn)(isoelectric point，pI)為4.5。GR 為谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)的重要組成部分，可利用還原型輔酶II(NADPH)將氧化型谷胱甘肽(GSSG)轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型谷胱甘肽(GSH)，以補(bǔ)充GSH 在氧化應(yīng)激狀態(tài)下的不斷消耗，使細(xì)胞內(nèi)GSH 與GSSG 的比值維持在一個(gè)固定水平(GSH/GSSG=100/1)。同時(shí)，GR 還可與超氧化物歧化酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶以及過氧化氫酶共同作用，清除體內(nèi)的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)［7］，共同構(gòu)成機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)。當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫時(shí)(包括空氣污染、強(qiáng)光、干旱、γ-射線、冷脅迫、熱脅迫、高壓氧脅迫以及重金屬等)，體內(nèi)會產(chǎn)生活性氧，GR 酶活性就會相應(yīng)升高，以抵抗氧化損傷。

閃式提取是一種新型的提取方法，其利用機(jī)械剪切力和超動(dòng)分子滲濾作用，可在極短時(shí)間內(nèi)使目標(biāo)提取物從細(xì)胞中釋放出來，是一種高效節(jié)能的提取方法。此外，由于閃式提取在常溫下操作，不會使生物活性物質(zhì)受熱破壞，因此，適合用于酶類的分離提取。本研究創(chuàng)新性地將其應(yīng)用于GR 的提取分離。

目前，GR 的提取分離研究主要集中于植物，而蚯蚓中GR 的研究還未見報(bào)道。本研究利用閃式提取與超聲提取相結(jié)合的方法對蚯蚓中的谷胱甘肽還原酶進(jìn)行了提取純化，并對其性質(zhì)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮凍蚯蚓購自北京大環(huán)順鑫有機(jī)肥料廠;DEAE Sepharose Fast Flow 瓊脂糖凝膠層析柱由GE Healthcare 生產(chǎn);氧化型谷胱甘肽(L-Glutathione oxidized，GSSG)購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司;還原型輔酶II 四鈉(NADPH Na4)由德國Roche 公司生產(chǎn);考馬斯亮藍(lán)G-250 由美國Amresco 公司生產(chǎn);SDS 聚丙烯凝膠電泳試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，意大利BEL Engieering srl 公司;JHBE-50 型閃式提取器，河南金鼎科技發(fā)展有限公司;SY-1000E 型多用途恒溫超聲提取機(jī)，北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司;900 型低溫冰箱，Thermo Scientific 公司;HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;ArantiTMJ-25 型低溫離心機(jī)，美國Beckman Coulter 公司;3000 型分光光度計(jì)，美國BIO-RAD 公司;DYY-7C 型電泳儀，北京市六一儀器廠;211 型pH 計(jì)，意大利HANNA 公司。

1.3 谷胱甘肽還原酶活性的檢測

谷胱甘肽還原酶的活性利用其催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)及還原型輔酶II(NADPH)的性質(zhì)來測定，采用楊偉宗等［8］的方法。酶活性單位定義為每分鐘消耗1 μmol NADPH 的GR 酶量。

1.4 蛋白質(zhì)濃度的測定

蛋白質(zhì)濃度由Bradford 法測定，使用牛血清白蛋白作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.0082 +0.0061C，R2=0.9992。

1.5 蚯蚓谷胱甘肽還原酶提取純化的工藝

蚯蚓谷胱甘肽還原酶的提取與純化工藝見圖1。

圖1 蚯蚓谷胱甘肽還原酶提取純化工藝流程Fig.1 Extraction and purification process of earthworm GR

1.6 粗酶液的制備

稱取100 g 新鮮凍蚯蚓，剪碎。加入4 倍體積緩沖液A(pH 8.0，含5 mmol/L EDTA 的5 mmol/L PBS 緩沖液)，以3500 r/s 閃提60 s，再以800 W 功率超聲提取30 min。后在-70 ℃冷凍12 h，融化后以11000 r/s 離心40 min，棄去沉淀，上清液即為蚯蚓GR 粗酶液。

1.7 谷胱甘肽還原酶提取條件的優(yōu)化

1.7.1 閃式提取單因素試驗(yàn)

取700 g 蚯蚓平均分成7 份，分別加入4 倍體積pH 值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，含5 mmol/L EDTA 的5 mmol/L PBS 緩沖液，以3500 r/s閃提60 s，再以800 W 功率超聲提取30 min。之后在-70 ℃冷凍12 h，融化后以11000 r/s 離心40 min，棄去沉淀，分別測上清液中的GR 酶活，以考察閃提pH 值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)對蚯蚓GR提取總酶活的影響。

取600 g 蚯蚓平均分成6 份，分別按料液比1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 加入不同體積的緩沖液A，以3500 r/s 閃提60 s，再以800 W 功率超聲提取30 min。后在-70 ℃冷凍12 h，融化后以11000 r/s離心40 min，棄去沉淀，分別測上清液中的GR 酶活，考察閃提料液比(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7)對蚯蚓GR 提取總酶活的影響。

取500 g 蚯蚓平均分成5 份，各加入4 倍體積緩沖液A，分別以3500 r/s 閃提30、45、60、75、90 s，再以800 W 功率超聲提取30 min。后在-70 ℃冷凍12 h，融化后以11000 r/s 離心40 min，棄去沉淀，分別測上清液中的GR 酶活，考察閃提時(shí)間(30、45、60、75、90 s)對蚯蚓GR 提取總酶活的影響。

1.7.2 超聲提取單因素試驗(yàn)

取600 g 蚯蚓平均分成6 份，各加入4 倍體積緩沖液A，以3500 r/s 閃提60 s，再以800 W 功率分別超聲提取0、15、30、45、60、75 min。后在-70 ℃冷凍12 h，融化后以11000 r/s 離心40 min，棄去沉淀，分別測上清液中的GR 酶活，考察超聲時(shí)間(0、15、30、45、60、75 min)對蚯蚓GR 提取總酶活的影響。

1.7.3 正交試驗(yàn)

選取單因素試驗(yàn)中對蚯蚓GR 總酶活影響較大的因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以進(jìn)一步優(yōu)化蚯蚓GR 的提取條件。

1.8 谷胱甘肽還原酶的純化

向粗酶液中緩慢加入3 倍體積丙酮(-20 ℃預(yù)冷)，在-20 ℃下靜置1 h。以11000 r/s 離心40 min，收集上清留待回收丙酮，用適量緩沖液A 溶解沉淀。向溶液中緩慢加入硫酸銨至飽和度達(dá)到30%，在4 ℃下靜置2 h。以11000 r/s 離心40 min，取上清，在4 ℃下對緩沖液A 透析2 h。將透析后的酶液過預(yù)先用緩沖液A 平衡的瓊脂糖凝膠層析柱(2.5 cm × 30 cm)。用含0.5 mol/L NaCl 的緩沖液A 洗脫，收集洗脫液，即為純化的GR 酶液。

1.9 谷胱甘肽還原酶分子量的測定

谷胱甘肽還原酶的分子量由SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳測定。蛋白質(zhì)條帶用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色。

1.10 pH 值和溫度對酶活性的影響

分別在不同的pH 值下測定GR 的活性，其余條件同標(biāo)準(zhǔn)測定方法，以研究GR 的最適pH 值。采用一系列緩沖液配制不同pH 值的檢測體系以測定最適pH 值，包括氯化鉀-鹽酸緩沖液(pH 值2.0)、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 值3.0～5.0)、PBS 緩沖液(pH 值6.0～8.0)、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH值9.0～10.0)及碳酸鈉-氫氧化鈉緩沖液(pH 值11.0)，緩沖液濃度均為0.1 mol/L。將純化的GR酶液分別調(diào)至上述pH 值，在37 ℃下水浴2 h，之后用標(biāo)準(zhǔn)檢測方法測定其剩余活性，以研究GR 的酸堿穩(wěn)定性。

GR 的最適溫度利用標(biāo)準(zhǔn)方法分別在20～80℃下測定。將純化后的GR 酶液分別在20～80 ℃下水浴2 h，再以標(biāo)準(zhǔn)測定方法測該酶剩余活性，以研究GR 的熱穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 GR 提取條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 閃式提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

閃提pH 值對蚯蚓GR 提取率的影響見圖2。pH 值由6.0 逐漸增大時(shí)，所提取的蚯蚓GR 總酶活也隨之逐漸增加，pH 增大到7.5 時(shí)，GR 的總酶活達(dá)到最大。隨著pH 值繼續(xù)增大，GR 的總酶活逐漸降低。因此，選擇pH 7.5 作為閃提最佳pH 值。

圖2 閃提pH 值對谷胱甘肽還原酶總酶活的影響Fig.2 Effect of pH on the total activity of GR

閃提料液比對蚯蚓GR 提取率的影響見圖3。加水倍數(shù)由2 倍開始增加，提取劑比例的增大使蚯蚓細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)釋放更加充分，所提取的蚯蚓GR總酶活也隨之增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶5 時(shí)，蚯蚓GR的總酶活達(dá)到最大值。之后，隨著加水比例的增大，GR 的總酶活反而呈下降趨勢，可能是原料被提取劑過度稀釋后，閃提的機(jī)械剪切機(jī)會減少，使得提取效率降低。另外，加水過多，使提取出的GR 被稀釋，提取液的離子強(qiáng)度降低，導(dǎo)致GR 失活。綜上，選擇1∶5 作為閃提最佳料液比。

圖3 閃提料液比對谷胱甘肽還原酶總酶活的影響Fig.3 Effect of solid/liquid ratio on the total activity of GR

圖4 閃提時(shí)間對谷胱甘肽還原酶總酶活的影響Fig.4 Effect of extraction time on the total activity of GR

閃提時(shí)間對蚯蚓GR 提取率的影響見圖4。閃提時(shí)間由30 s 增加到45 s 時(shí)，蚯蚓GR 總酶活顯著增大，但閃提時(shí)間繼續(xù)增加，GR 總酶活基本保持不變。因此，選擇45 s 作為最佳閃提時(shí)間。

2.1.2 超聲提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

超聲時(shí)間對蚯蚓GR 提取率的影響見圖5。超聲波可將細(xì)胞破碎，隨著超聲時(shí)間的增加，蚯蚓GR總酶活也隨著增加，在15 s 時(shí)，GR 總酶活達(dá)到最大值。但是，超聲時(shí)間超過30 s 后，GR 總酶活反而隨超聲時(shí)間的增加而下降，這可能是由于超聲波的輻射及熱能作用于酶蛋白，會使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶失活。綜上，選擇15 s 作為最優(yōu)超聲時(shí)間。

圖5 超聲時(shí)間對谷胱甘肽還原酶總酶活的影響Fig.5 Effect of ultrasonic treatment time on the total activity of GR

2.1.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇pH 值、料液比及超聲時(shí)間這個(gè)對提取率影響較大的因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，各因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

正交試驗(yàn)的結(jié)果見表2。由結(jié)果可知，各因素的最優(yōu)組合為A2B2C3，即最優(yōu)條件為:pH 值7.5，料液比1∶5，超聲時(shí)間25 min。由極差分析可知，各因素對蚯蚓GR 總酶活的影響大小順序依次為B ＞A ＞C。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of L9(34)experimental design for the extraction of GR

正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果見表3。由離差平方和可知，對GR 總酶活影響大小依次為B ＞ A ＞C，與正交試驗(yàn)的結(jié)論一致。其中，閃提料液比對蚯蚓GR 提取率的影響顯著(P＜0.05)，其次為閃提pH 值(P＜0.10)，而超聲時(shí)間對GR 提取率的影響不顯著，因此，為節(jié)約能源，選擇最低水平15 min 作為最優(yōu)超聲時(shí)間。

綜合以上分析，確定蚯蚓GR 提取的最優(yōu)工藝條件為:pH 值7.5，料液比1∶5，超聲時(shí)間15 min。

表3 方差分析Table 3 ANOVA of the GR extraction

2.2 谷胱甘肽還原酶的純化結(jié)果

利用上述最優(yōu)條件得到的蚯蚓GR 提取純化結(jié)果見表4。最終，從蚯蚓中提取的谷胱甘肽還原酶純化了32.3 倍，回收率達(dá)到58.4%。其他來源的GR 與蚯蚓GR 的比較情況見表5。經(jīng)比較可知，從蚯蚓中提取純化的GR 具有更高的比活力，且用本研究所確定的提取方法能夠保證相對較高的回收率，同時(shí)蚯蚓生物量極大，更易獲得。因此，蚯蚓GR 更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

表4 蚯蚓谷胱甘肽還原酶純化結(jié)果Table 4 Purification results of GR

表5 其他來源的谷胱甘肽還原酶與蚯蚓谷胱甘肽還原酶提取分離情況比較Table 5 Comparison of purification of GR from earthworm with GR from other sources

2.3 SDS-PAGE 測定分子量結(jié)果

各步驟酶液的SDS-PAGE 電泳結(jié)果見圖6。粗酶液中的大部分雜蛋白經(jīng)丙酮沉淀及硫酸銨沉淀去除，而經(jīng)過DEAE-Sepharose 柱后，蚯蚓GR 被純化至單一條帶。與Marker 進(jìn)行對照，可知蚯蚓GR 的分子量大約為110 kDa。

圖6 蚯蚓谷胱甘肽還原酶的SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.6 SDS-PAGE pattern of the purified GR

圖7 蚯蚓谷胱甘肽還原酶的最適pH 值及酸堿穩(wěn)定性Fig.7 Effects of pH on the activity and stability of earthworm GR

2.4 谷胱甘肽還原酶的最適pH 值及酸堿穩(wěn)定性結(jié)果

pH 值對蚯蚓GR 活性的影響如圖7 所示。GR在pH 8.0 時(shí)相對酶活具有最大值，此與綿羊肝臟GR 的最適pH 相一致。在不同pH 值下水浴2 h后，GR 酶活在pH 6.0～8.0 之間可保持最大活性的85%以上，而在pH 3.0 以下，GR 完全失活。

2.5 谷胱甘肽還原酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性

溫度對蚯蚓GR 活性的影響如圖8 所示。溫度在50 ℃時(shí)，蚯蚓GR 具有最大酶活性。這與孫虎山等［9］對櫛孔扇貝血液中GR 的研究結(jié)果相同。溫度在40 ℃以下時(shí)，水浴2 h 后蚯蚓GR 活性基本可保持穩(wěn)定。50 ℃以上，GR 穩(wěn)定性迅速下降，2 h 后僅剩50%。60 ℃以上水浴2 h 后，GR 活性完全喪失。

圖8 蚯蚓谷胱甘肽還原酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性Fig.8 Effects of temperature on the activity and stability of earthworm GR

3 結(jié)論

本研究實(shí)現(xiàn)了利用閃式提取與超聲提取相結(jié)合的方法從蚯蚓中提取純化GR，并對GR 的性質(zhì)進(jìn)行了研究。純化得到的GR 分子量為110 kDa。蚯蚓GR 的最適pH 及溫度分別為8.0，50 ℃。利用蚯蚓提取純化的GR 比活力及收率與其他來源的GR 相比均較高，且蚯蚓較其他原料更易獲取，因此，蚯蚓是生產(chǎn)GR 的一種較好來源。本研究確立了一種高效的GR 提取分離方法，為未來GR 的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造了條件。

1 Ma JJ (馬靜靜)，Zhang W (張偉)，Zheng B (鄭彬)，et al.Multiple-time addition of benzo［α］pyrene in soil declined its toxic effects onEisenia foetidacoelomocytes.J Nanjing Agric Univ(南京大學(xué)學(xué)報(bào))，2014，37:77-82.

2 He YS，Xu XY，Gao XL，et al.Response of SOD activity of earthworm to soil plumbum pollution.Agric Sci Technol，2014，02:212-214.

3 Dong WH (董煒華)，Han DF (韓德復(fù))，Wu XW (吳祥文)，et al.The growth and reproduction of earthworm in the different polluted soil.J Changchun Normal Univ(長春師范學(xué)院學(xué)報(bào))，2013，12:92-95.

4 Wang DD (王丹丹)，Wu LJ (巫麗俊)，Dai Y (戴瑩)，et al.Effects of earthworm on soil nutrients and Zn chemical forms in Zn contaminated soil.Soil(土壤)，2013，06:1048-1054.

5 Liao Y (廖怡)，Rong YH (榮永海)，Rong L (榮龍).Combined extraction of superoxide dismutase and catalase from earthwormEisenia fetida.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2012，11:1538-1544.

6 Shang GN (商桂娜)，Rong YH (榮永海)，Rong L (榮龍).Extraction and purification of GSH-Px from earthworm.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2013，01:76-82.

7 Lin YX (林源秀)，Gu XX (顧欣昕)，Tang HR (湯浩茹).Characteristics and biological functions of glutathione reductase in plants.Chin J Biochem Molecul Biol(中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào))，2013，06:534-542.

8 Yang WZ (楊偉宗)，Yin YJ (殷怡靜)，Shen FN (沈斐納)，et al.Determination of activity of glutathione reductase from erythrocyte.Chin J Clin Lab Sci(臨床檢驗(yàn)雜志)，1988，01:11-12.

9 Sun HS (孫虎山)，Wang HN (王海娜)，Wang YY (王宜艷).Study on activities of glutathione reductase in the haemolymph ofChlamys Farreri.Mar Sci Bull(海洋通報(bào))，2007，06:108-112.