劉 婷，尚 姣，王 慧，鄭娟娟，趙 潔，房敏峰

西部資源生物與現(xiàn)代生物技術教育部重點實驗室 西北大學生命科學學院，西安 710069

金刷把為松蘿科植物金絲刷Lethariella cladonioides(NyL.)Krog.的干燥枝狀體［1］，具有鎮(zhèn)靜、止痛、消炎等作用，主治精神分裂、神經(jīng)衰弱、頭暈目眩等癥［2］。金刷把作為地衣類藥材，含有地衣酸、地衣多糖等成分［2，3］，其中地衣多糖表現(xiàn)出良好的抗氧化、抗腫瘤活性［4］。閆寶琦等［5］研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)熱水提取乙醚沉淀反復精制所得的金刷把多糖，為一組均勻多糖;管玉成等［6］研究發(fā)現(xiàn)蒽酮-硫酸法適用于金刷把多糖的含量測定;王慧等［7］研究發(fā)現(xiàn)金刷把多糖具有抑制HeLa、A375 和Hip G2 細胞體外生長增殖作用。因此，本實驗在單因素試驗的基礎上，應用響應面法優(yōu)化金刷把多糖的提取工藝，以期為金刷把多糖的進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金刷把采自太白山，經(jīng)西北大學王瑪麗教授鑒定。葡萄糖(中國藥品生物制品檢定所，批號:110833-200904);乙醇、石油醚、蒽酮、濃硫酸(科密歐化學試劑有限公司);水為蒸餾水。U-3310 紫外-可見分光光度計(日本日立公司);HC-3018 高速離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司);VFD-21S 冷凍干燥儀(Heto-Holten 公司);FA2004 型電子分析天平(上海良平儀器儀表有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 金刷把多糖提取及制備

取藥材粉末100 g 于圓底燒瓶中，按一定水浴溫度、浸提時間和料液比在熱水浴中回流提取數(shù)次，冷卻后過濾，合并上清液;上清液中加入一定體積95%乙醇沉淀。沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，干燥后得金刷把多糖粗品。將金刷把多糖粗品溶于水制成多糖溶液，TCA +Sevag 法除蛋白，重復多次，直至多糖中無蛋白沉淀為止。取50 mL去除蛋白后的多糖溶液置于三角瓶中，向其中加入預處理的D101 樹脂2 g，在磁力攪拌下吸附1 h 后過濾，分別收集濾液和樹脂。濾液用乙醇沉淀后再用乙醇和丙酮洗滌，冷凍干燥，得到脫蛋白、脫色的金刷把多糖。

1.2.2 多糖標準曲線的繪制

稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖10 mg 于100 mL 容量瓶中，蒸餾水定容至刻度后搖勻，即得葡萄糖標準溶液，分別吸取該溶液0、0.2、0.4、0.8、1 mL。蒸餾水定容至1 mL，分別取配制好的溶液1 mL 于帶塞試管中，加入2%硫酸-蒽酮試劑4 mL，搖勻，沸水浴10 min 顯色，待溫度降為常溫，以蒸餾水為空白對照，于620 nm 處測定吸光值。以葡萄糖溶液的濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得Y=0.0425X+0.0147，R2=0.9991，結(jié)果表明兩變量有很強的線性相關性。

1.2.3 多糖得率的測定

采用蒽酮-硫酸比色法，精密量取多糖溶液1 mL，按上述步驟于620 nm 處測定吸光值，根據(jù)標準曲線計算多糖含量。多糖得率(%)=提取得到的多糖質(zhì)量/藥材粉末重量×100%

1.2.4 單因素試驗

分別選取提取溫度、提取時間、料液比、提取次數(shù)四因素做單因素試驗，取三次重復的平均值，考察各因素對金刷把粗多糖得率的影響。

1.2.4.1 提取溫度對多糖得率的影響

選取提取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃，在料液比1∶20 g/mL，提取時間2 h，提取2 次的條件下，考察提取溫度對多糖得率的影響。

1.2.4.2 提取時間對多糖得率的影響

選取提取時間分別為0.5、1、2、3、4 h，在料液比1∶20 g/mL，提取溫度90 ℃，提取2 次的條件下，考察提取時間對多糖得率的影響。

1.2.4.3 料液比對多糖得率的影響

選取料液比分別為1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1∶50 g/mL，在提取溫度90 ℃，提取時間2 h，提取2次的條件下，考察料液比對多糖得率的影響。

1.2.4.4 提取次數(shù)對多糖得率的影響

選取提取次數(shù)分別為1 次、2 次、3 次、4 次、5次，在料液比1∶20 g/mL，提取溫度90 ℃，提取時間2 h 的條件下，考察提取次數(shù)對多糖得率的影響。

1.2.5 響應面設計

綜合單因素實驗結(jié)果，根據(jù)Box-Benhnken 中心組合實驗設計原理，選取提取溫度、提取時間、料液比3 個因素為自變量，多糖提取率為響應值，設計3因素3 水平的二次回歸方程來擬合自變量多糖提取率之間的函數(shù)關系，采用響應面分析方法優(yōu)化提取工藝。實驗設計的因素水平見表2，共15 個實驗點，其中12 個為析因點，3 個為零點。各因素水平及編碼見表1。

表1 響應面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels of RSM analysis

1.2.6 數(shù)據(jù)分析處理

用Design-Expert 8.0.6 軟件對實驗數(shù)據(jù)分析，并對各因素間的交互作用做回歸分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 單因素試驗結(jié)果

提取溫度對多糖得率的影響如圖1(A)，結(jié)果表明:隨著溫度的升高，地衣多糖的得率呈不斷增加的趨勢，但考慮操作的可行性與安全性，最終選擇最佳溫度為90 ℃。

提取時間對多糖得率的影響如圖1(B)，結(jié)果表明:多糖得率與時間密切相關，在時間低于2 h 多糖得率有所提高，2 h 以后趨于平緩。原因可能為時間短，產(chǎn)物不充分溶解;時間過長，可能引起產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的改變，從而導致得率降低。故多糖最佳提取時間為2 h。

料液比對多糖得率的影響如圖1(C)，結(jié)果表明:料液比對多糖得率也有影響，金刷把在料液比為1∶20 g/mL 時，其多糖提取率出現(xiàn)最大值，之后多糖提取率變化不明顯，故多糖得率最佳料液比為1∶20 g/mL。

提取次數(shù)對多糖得率的影響如圖1(D)，結(jié)果表明:多糖得率并沒有隨提取次數(shù)的增加而呈顯著上升趨勢，故提取次數(shù)對多糖得率影響并不突出?？紤]到操作的簡便性，提取次數(shù)定為2 次。

圖1 提取溫度(A)、提取時間(B)、料液比(C)及提取次數(shù)(D)對金刷把多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature (A)，extraction duration (B)，solid to liquid ratio (C)and times of extraction (D)on extraction yield of polysaccharide from L.cladonioides

2.2 響應面分析法優(yōu)化金刷把多糖提取工藝

2.2.1 回歸方程建立與方差分析

采用Design Expert 8.0.6 軟件設計響應面方案見表2，對表2 數(shù)據(jù)進行處理和分析，得到金刷把多糖提取率的二元多次回歸方程為:

對二次回歸方程的響應面模型方差分析結(jié)果如表3 所示，從表3 可以看出，模型P＜0.01，表明該模型達到極顯著水平，試驗方法可靠。回歸方程失擬項極顯著，說明未知因素對試驗結(jié)果干擾比較大。復相關系數(shù)R2=0.9464 ＞0.9909，說明該模型變量與自變量之間的關系顯著，回歸方程與實際情況擬合度高，校正決定系數(shù)說明該模型能解釋97.44%響應值的變化，僅有總變異的2.56%不能用此模型來解釋，變異系數(shù)CV=4.02% ＜5%，說明模型的重現(xiàn)性較好，其實驗設計是合理的，試驗具有很高的可信度和準確性，可以用于多糖得率的預測。

回歸方程各項的方差分析表明:X1、X2、X3 均達到極顯著水平，二次項X12、X22、X32對多糖提取率的影響極顯著，說明二次項響應值影響極大。因此，利用該回歸方程確定的最佳提取工藝是可用的。

表2 響應面實驗方案設計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface analysis

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance for the regression equation

2.2.2 響應面以及等高線分析

在考察的區(qū)域內(nèi)根據(jù)回歸分析方程繪制響應面圖及其等高線圖可直觀反應各因素和響應值及各考察因子之間的交互作用。利用SAS 繪制各種因子對得率的響應面和等高線圖，結(jié)果見如圖2。

圖2(a)可知，在試驗水平范圍內(nèi)，隨著提取溫度的增加金刷把多糖得率呈先增加后緩慢降低的趨勢，提取時間較短時提取溫度的影響顯著，在提取時間較長時提取溫度對金刷把多糖得率影響不大。由圖2(a)及方差分析可知，提取溫度要比提取時間對多糖的提取率影響更大。

圖2(b)可知，在試驗水平范圍內(nèi)，提取溫度軸向等高線密集，變化較陡;料液比向等高線稀疏，變化較緩，表明提取溫度比料液比對金刷把多糖提取得率的影響大。

圖2(c)可知，在試驗水平范圍內(nèi)，隨著提取時間的增加金刷把多糖得率呈先增加后緩慢降低的趨勢，而料液比對多糖得率影響不明顯，且料液比等高線較提取時間稀疏。由圖(c)及方差分析可知，提取時間比料液比對多糖得率影響大。

綜合以上分析可知，溫度是影響金刷把多糖提取率的重要因素，且影響為提取溫度＞提取時間＞料液比。

通過模型得到的最優(yōu)條件為T=93.54 ℃，t=2.41 h，g/v=21.77(v/m，mL/g)，在此條件下多糖提取率理論上可達到4.62%?？紤]到實際情況，將最優(yōu)條件調(diào)整為T=95 ℃，t=2.5 h，g/v=20(v/m，mL/g)，修正條件下，進行三次重復驗證試驗，得到實際提取率為4.42% ±1.3%(n=3)，說明模型能較好的預測實際提取率。

圖2 因素交互作用對多糖提取率影響的響應面和等高線圖Fig.2 Response surface plots showing the effects of extraction parameters on the extraction yield of polysaccharides

3 結(jié)論與討論

本實驗在單因素試驗的基礎上，采用響應面試驗設計方法對金刷把多糖提取工藝進行優(yōu)化，實驗得到的回歸模型顯著。依據(jù)回歸分析結(jié)果得到金刷把多糖的最佳提取條件為:提取溫度95 ℃、提取時間2.5 h、液料比1∶20 g/mL，在此條件下金刷把多糖提取率理論值達到4.62%，多糖得率的實驗值為4.42%，與模型理論值的相對誤差為4.3%，所建立的模型能較好的預測多糖提取的實際提取率。

響應面法可以在更廣泛的范圍內(nèi)考慮因素的組合，并對響應值進行預測，從而得到更可靠的優(yōu)化工藝條件。王洪政等［8］對牡丹果莢多糖、鄭林龍等［9］對土茯苓多糖、紀鵬等［10］對當歸多糖的提取工藝條件都進行了優(yōu)化，證明利用響應面分析法優(yōu)化多糖提取工藝具有較高的效率、優(yōu)越性及巨大的發(fā)展?jié)摿Α１驹囼灷庙憫娣▽鹚讯嗵翘崛」に囘M行了優(yōu)化，建立了金刷把多糖提取的技術體系，這將為研究其余地衣多糖工藝研究提供一個良好的技術平臺。

金刷把主要分布于陜西、甘肅、西藏、云南和四川等地，陜西民間習用于治療癲癇、精神分裂等癥［11］，為‘太白七藥’之一，主要含有松蘿酸和多糖成分，其中由松蘿酸所制成的鈉鹽是臨床廣泛應用的抗菌藥［12］，而金刷把多糖的生物活性有待于開發(fā)利用。因此，本實驗通過響應面法優(yōu)化出了金刷把多糖的提取工藝，為進一步分離純化和生物活性研究奠定了基礎。

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