許亞楠，熊 婷，曾東強(qiáng)，劉曉亮，唐文偉

廣西大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，南寧 530005

山橙Melodinus suaveolens，又名馬騮藤、猢猻果、猴子果，為夾竹桃科山橙屬植物，主要分布于我國廣東、廣西等地;果實(shí)具有行氣、止痛、除濕、殺蟲等功效，用于治療胃氣痛、膈癥、疝氣、瘰疬、皮膚熱毒、濕癬疥癩［1］。近年來，山橙屬植物以其含有結(jié)構(gòu)新穎的單萜吲哚型生物堿引起了一些學(xué)者的關(guān)注［2，3］。目前，對山橙的研究僅限于化學(xué)成分的分離和鑒定。迄今為止，國內(nèi)外學(xué)者從山橙枝葉中已分離60 余種化合物，主要為生物堿類成分［4-7］。關(guān)于其活性的研究主要集中在對癌細(xì)胞的抑制方面，在農(nóng)業(yè)方面的活性罕有涉及。張方平等人在研究25 種熱帶植物乙醇粗提物對比哈小爪螨P.citri驅(qū)避作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)山橙的乙醇粗提物對比哈小爪螨的產(chǎn)卵驅(qū)避率達(dá)到100%，對成螨的驅(qū)避率達(dá)到94%［8］。這說明該植物在防治農(nóng)業(yè)害蟲方面的活性值得進(jìn)一步探索。

本研究通過同時(shí)蒸餾萃取法(SDE)從山橙葉中提取精油，對其在防治農(nóng)業(yè)害蟲方面的活性進(jìn)行了初步探索，為山橙資源的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。通過測定山橙葉粗提物及精油對榕管薊馬、柑橘全爪螨的殺蟲活性，為進(jìn)一步挖掘山橙的應(yīng)用價(jià)值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山橙M.suaveolens，采自廣西十萬大山，由廣西林業(yè)勘探設(shè)計(jì)院鐘業(yè)聰高級工程師鑒定;榕管薊馬G.uzeli采自廣西大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地，寄主為雅榕Ficus concinnaMiq.。柑橘全爪螨P.citri采自廣西大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地，寄主為毛葉棗Zizyphus mauritianaLam.。試蟲采集回后室內(nèi)飼養(yǎng)，第2 代作為生測蟲源;正己烷、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、氯化鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

同時(shí)蒸餾萃取裝置(安徽天長市長城玻璃儀器制造廠);98-1-C 型電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司);HH-S 電子恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠);RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);冷卻水循環(huán)器(施都凱儀器設(shè)備上海有限公司);電子天平PL203(梅特勒—托利多儀器上海有限公司);高倍體視顯微鏡(德國ZEISS 公司);光照培養(yǎng)箱(金壇市天宏實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 植物粗提物的提取

將采集的供試材料，分別放在通風(fēng)處陰干，粉碎。將植物粉末38 kg 分置入大型容器(20 L)中，用5 倍量(體積比)的甲醇在室溫下用冷浸法提取，72 h 后過濾，收集濾液，共提取3 次，合并濾液，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾濃縮，合并多次濃縮物得到植物的甲醇粗提物，置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 植物粗提物的萃取分離

將山橙甲醇粗提物3.7 kg 用蒸餾水充分熱溶(水溫低于50 ℃)，裝入分液漏斗懸浮，分別用等體積石油醚、乙酸乙酯萃取3 次，減壓濃縮得石油醚層(403 g)、乙酸乙酯(667 g)和水層(504 g)濃縮稠膏，置冰箱中冷藏備用。

1.3.3 山橙精油的提取

準(zhǔn)確稱量山橙的新鮮葉片50 g，剪成面積為1～2 cm2左右的碎片，置于1000 mL 圓底燒瓶中。按規(guī)定水料比加入蒸餾水，溶解一定量的NaCl，輕輕振搖2 min，使水淹沒葉片。浸泡適當(dāng)時(shí)間后，將燒瓶接入同時(shí)蒸餾萃取裝置的沸水蒸餾端;另取一500 mL 圓底燒瓶，加入120 mL 正己烷，接入同時(shí)蒸餾萃取的水浴端(70 ℃恒溫);打開水浴鍋和電熱套開關(guān)，加熱至水和正己烷沸騰，控制加熱溫度和冷凝水流速，以使隨水蒸氣上升的精油在冷凝后及時(shí)并充分地轉(zhuǎn)移至正己烷中。裝有葉片的燒瓶停止加熱后，需繼續(xù)供應(yīng)正己烷蒸氣10 min 左右。同時(shí)蒸餾萃取結(jié)束后，收集正己烷萃取液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，濃縮至3～5 mL 后，用N2吹出殘留溶劑得到油狀物即為山橙葉精油。

1.3.4 生物活性測定

1.3.4.1 榕管薊馬的生物活性測定

參考Alfredo 和Anthon 的TIBS 法［9］，經(jīng)適當(dāng)修改建立葉管藥膜法。將供試樣品以丙酮溶解，再加蒸餾水配制對應(yīng)濃度(丙酮含量不超過5%)。用移液管取適量藥液加入到20 mL 的玻璃指形瓶中，均勻滾動，使藥液在玻璃指形瓶內(nèi)壁形成均勻的藥膜。再將小葉榕的新鮮葉片(2 cm×3 cm)在藥液中浸5 s，取出自然晾干再放入藥膜瓶中，用毛筆輕輕移入30 頭左右的榕管薊馬成蟲，用保鮮膜封口(扎小孔)，處理過的試蟲置于25 ±1 ℃，RH 75%的光照培養(yǎng)箱中，24 h 后調(diào)查死亡率。每個(gè)處理3 次重復(fù)，設(shè)5%丙酮的蒸餾水作對照。

1.3.4.2 柑橘全爪螨的生物活性測定

參照FAO(聯(lián)合國糧農(nóng)組織)推薦的玻片浸漬法［10，11］并加以改進(jìn)。供試樣品以丙酮溶解，再加蒸餾水配制對應(yīng)濃度(丙酮含量不超過5%)。用柔軟的細(xì)毛筆輕輕挑選雌成螨，將其背部粘在雙面膠帶上(注意不能粘住螨足、螨須、口器)，每片粘3 行，每行10 頭左右，剔除死亡或生命力較弱的個(gè)體并補(bǔ)充。將帶螨玻片的一端浸入藥液中5 s 左右后取出，迅速用吸水紙吸干螨體及其周圍多余的藥液，然后將處理過的試蟲放置于溫度為25 ± 1 ℃，RH 75%的光照培養(yǎng)箱中，24 h 后，在雙目解剖鏡下檢查結(jié)果，用毛筆輕觸螨體，螨足不動視為死亡。每處理3 次重復(fù)，設(shè)含5%丙酮的蒸餾水對照。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0 及Excel 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，LC50值及毒力回歸方程均使用概率值法計(jì)算，方差分析采用鄧肯氏極差多重比較法(Duncan’s Multiple Ranger Test，DMRT)。

2 結(jié)果與分析

2.1 十一種植物粗提物對榕管薊馬的殺蟲活性

在10 mg/mL 濃度下，以藥膜法測定了采自廣西十萬大山的十一種植物甲醇粗提物對榕管薊馬成蟲的殺蟲活性。結(jié)果如表1。

表1 十一種植物甲醇粗提物對榕管薊馬的殺蟲活性(10 mg/mL)Table 1 Insecticidal toxicities of the methanol extracts of 11 plants against the G.uzeli at the concentration of 10 mg/mL

從11 種植物甲醇粗提物對榕管薊馬的生物活性測定結(jié)果可以看出，山橙葉粗提物對榕管薊馬具有顯著的生物活性，處理后72 h 校正死亡率達(dá)到76.89%;毒根斑鳩菊次之，處理后72h 校正死亡率為60.32%;狹葉坡壘和山橙果對榕管薊馬活性較弱，處理后72h 校正死亡率均為50%左右;尖山橙、土常山、山菅蘭、鋸葉竹節(jié)樹對榕管薊馬的活性微弱，杜蚣花、大山橙和龍州山橙果對其無顯著活性。

2.2 山橙葉粗提物及精油對榕管薊馬的殺蟲活性

針對活性篩選結(jié)果中山橙葉粗提物對榕管薊馬具有顯著的生物活性，進(jìn)一步采用改進(jìn)后的葉管藥膜法測定山橙葉粗提物及精油對榕管薊馬處理24 h后的毒力，結(jié)果如表2。

表2 山橙葉粗提物及精油對榕管薊馬的毒力Table 2 The toxicity of the methanol extract and essential oil from M.suaveolens leaves against G.uzeli

生物測定結(jié)果顯示，山橙葉精油對榕管薊馬活性較弱，山橙葉粗提物對榕管薊馬活性較好，處理24 h 后的LC50值為12.7271 mg/mL。

2.3 山橙葉粗提物各萃取層對榕管薊馬的殺蟲活性

為了進(jìn)一步探究活性成分在山橙枝葉中的分布部位，本研究對山橙葉甲醇粗提物進(jìn)行了萃取分離，測定了山橙葉粗提物各萃取層在10 mg/mL 濃度下對榕管薊馬的生物活性，結(jié)果如下表3。

綜合分析山橙葉粗提物各萃取層對榕管薊馬的活性，結(jié)果表明山橙粗提物中對榕管薊馬具有活性的物質(zhì)主要集中于乙酸乙酯萃取層中。在10 mg/mL 的濃度下，處理24 h 后的校正死亡率為72.30%，處理48 h 后的校正死亡率為96.33%。并進(jìn)一步測定了乙酸乙酯萃取層對榕管薊馬的毒力，結(jié)果如表4，處理24 h 后LC50值為4.9507 mg/mL，處理48 h 后LC50值為2.0384 mg/mL，處理72 h 后LC50值為1.5042 mg/mL。這一結(jié)果表明有必要對山橙甲醇粗提物的乙酸乙酯萃取層進(jìn)一步分離，從而找到對榕管薊馬具有殺蟲活性的化合物。

表3 山橙葉粗提物各萃取層(10 mg/mL)對榕管薊馬成蟲的殺蟲活性Table 3 Insecticidal activity of different fractions of M.suaveolens leaves against G.uzeli at the concentration of 10 mg/mL

表4 山橙葉粗提物乙酸乙酯層對榕管薊馬的毒力Table 4 The toxicities of EtOAc-soluble of M.suaveolens leaves against G.uzeli

2.4 山橙葉粗提物及精油對柑橘全爪螨的生物活性

目前，尚未有關(guān)于山橙活性成分在農(nóng)業(yè)害蟲防治方面的報(bào)道，僅有只字片語涉及到山橙粗提物對螨的活性，結(jié)果不詳。為了便于比較，本研究除了系統(tǒng)地測定了山橙葉粗提物及精油對榕管薊馬的活性外，還采用玻片浸漬法測定了山橙葉粗提物及精油對柑橘全爪螨雌成螨的毒力。處理24 h 后的結(jié)果如表5。

表5 山橙葉粗提物及精油對柑橘全爪螨雌成螨的毒力Table 5 The toxicity of the methanol extract and essential oil from M.suaveolens leaves against P.citri

表5 的結(jié)果表明，山橙葉精油對柑橘全爪螨雌成螨具有顯著的殺蟲活性，處理后24 h 的LC50值為0.4142 mg/mL。而山橙葉粗提物對柑橘全爪螨活性較弱，處理后24 h 的LC50值為5.5524 mg/mL。從而可以推斷對柑橘全爪螨具有殺蟲活性的成分存在于精油中，而非山橙葉粗提物中。今后可對山橙葉精油化學(xué)成分做進(jìn)一步分析，尋找對柑橘全爪螨具有殺蟲活性的化學(xué)成分。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對十一種植物粗提物進(jìn)行了活性篩選，測定了不同濃度的山橙葉粗提物、精油對榕管薊馬、柑橘全爪螨雌成螨的殺蟲活性，以及山橙各萃取層對榕管薊馬的殺蟲活性。以往文獻(xiàn)中對殺蟲活性成分進(jìn)行追蹤時(shí)主要采取分離純化，對精油的研究尚屬空白，本實(shí)驗(yàn)首次通過SDE 法提取了山橙葉精油，并對其進(jìn)行了活性測定，從而為準(zhǔn)確定位活性成分存在部位奠定了基礎(chǔ)。其中，山橙葉粗提物及精油對柑橘全爪螨表現(xiàn)較好的觸殺活性，處理24 h 后LC50值分別為5.5524、0.4142 mg/mL。今后有必要對山橙葉精油深入研究，以尋找對柑橘全爪螨有活性的化學(xué)成分。山橙葉粗提物乙酸乙酯萃取層對榕管薊馬處理48 h 后的LC50值為2.0384 mg/mL，但山橙葉精油對榕管薊馬活性較低。從而推測，山橙葉中對榕管薊馬具有殺蟲活性的成分集中在乙酸乙酯層，對柑橘全爪螨具有殺蟲活性的成分存在于精油中。實(shí)際生產(chǎn)中，對榕管薊馬的防治多采用化學(xué)措施，容易造成害蟲抗藥性增強(qiáng)、藥害等問題，本研究結(jié)果可為研發(fā)防治榕管薊馬的新藥劑提供思路。

目前，尚未有關(guān)于山橙葉精油對柑橘全爪螨的殺螨活性的研究報(bào)道。作為一種世界性的柑橘害螨，柑橘全爪螨通過吸食柑橘葉片、嫩梢、花蕾和果實(shí)的汁液造成減產(chǎn)、品質(zhì)下降和樹體早衰。當(dāng)前防治該害蟲的主要手段仍然是施用化學(xué)農(nóng)藥，但化學(xué)農(nóng)藥長期不合理使用嚴(yán)重影響了果品質(zhì)量安全，并造成柑橘全爪螨的抗藥性增強(qiáng)和生態(tài)環(huán)境的破壞，更限制了我國柑橘的出口貿(mào)易［12］。因此，研究開發(fā)新的高效、低毒、對環(huán)境友好的植物源殺螨劑對柑橘生產(chǎn)具有重要意義。本研究結(jié)果顯示山橙葉精油對柑橘全爪螨活性較好，有必要進(jìn)一步研究萃取條件對精油提取率的影響，從而為山橙精油的應(yīng)用及殺螨新藥的研制提供理論依據(jù)。

本研究采用同時(shí)蒸餾萃取法(SDE)提取了山橙葉精油，可大幅度節(jié)省萃取時(shí)間。相比傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法，不僅節(jié)省了溶劑，而且免去人為操作帶來的污染，較為可取。

綜上所述，研究結(jié)果顯示了山橙在農(nóng)業(yè)害蟲防治領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用前景，據(jù)此推測山橙所含活性成分在農(nóng)業(yè)害蟲防治方面的潛力巨大。今后，需進(jìn)一步系統(tǒng)分離山橙葉甲醇粗提物的乙酸乙酯萃取層，并研究其對榕管薊馬的作用機(jī)理。同時(shí)，有必要研究山橙葉精油有效成分的分離、提取，探究山橙葉精油對柑橘全爪螨的作用方式、作用機(jī)理等。通過這樣一系列的研究，可探索山橙在農(nóng)業(yè)害蟲防治方面的價(jià)值，為進(jìn)一步探究山橙精油化學(xué)成分，尤其是開發(fā)利用山橙中對榕管薊馬具有殺蟲活性的天然產(chǎn)物成分提供了理論依據(jù)。

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