楊書堯，劉 莉，馬躍超，陳 寧，謝希賢

(代謝控制發(fā)酵技術國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

利巴韋林，化學名1–β–D–呋喃核糖基–1,H–1，2，4–三氮唑–3–羧氨酰，又名病毒唑，是一種高效廣譜的核苷類抗病毒藥物，對多種DNA 和RNA 病毒均有較好的抑制作用[1].利巴韋林的生產方法有化學合成法、酶催化法和微生物發(fā)酵法.目前化學合成法是合成利巴韋林的主要生產方法，但是化學合成法步驟繁瑣、條件苛刻.酶催化法主要是利用嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)催化底物核苷或D–核糖–1–磷酸酯與1，2，4–三氮唑–3–羧氨酰(TCA)反應，直接合成利巴韋林[2].雖然酶催化法可以簡化反應步驟、條件簡單，但誘導劑的添加提高了生產成本且不利于后續(xù)的分離純化.發(fā)酵法合成利巴韋林原料簡單、污染小，具有工業(yè)化生產的潛力.古屋晃等[3]利用產核苷的枯草芽孢桿菌屬和短桿菌屬的微生物進行發(fā)酵培養(yǎng)積累利巴韋林，但利巴韋林產量小于1,g/L.武改紅等[4]以鳥苷產生菌枯草芽孢桿菌TM903 為供試菌，在5,L 發(fā)酵罐發(fā)酵60,h 積累利巴韋林5.86,g/L.謝希賢等[5]利用枯草芽孢桿菌 TM903 和谷氨酸棒桿菌TL1105 進行發(fā)酵罐混菌發(fā)酵，采用變溫控制模式和分階段供氧控制模式發(fā)酵60,h，利巴韋林產量達到5.96,g/L.

PNP 是嘌呤核苷補救合成途徑的關鍵酶之一，該酶的主要功能是催化核苷分解為核糖–1–磷酸和相應的嘌呤堿基.在體外反應時，若加入另外一種嘌呤堿基或其類似物，可以合成新的嘌呤核苷或其類似物，現(xiàn)已廣泛用于酶催化法生產核苷類抗病毒藥物[6].Bzowska 等[7]根據(jù)PNP 底物專一性和相對分子質量大小的不同將PNP 分為低相對分子質量同源三聚體類和高相對分子質量同源六聚體類.某些微生物會同時存在兩種聚體的PNP，如枯草芽孢桿菌.

影響發(fā)酵法合成利巴韋林的主要因素是前體物核苷和PNP.理論上嘌呤核苷和嘧啶核苷都可作為利巴韋林的合成前體，但綜考慮生產成本與PNP 的催化效率，嘌呤核苷更合適.研究表明，肌苷是PNP的最適底物[8].本文以肌苷生產菌枯草芽孢桿菌B.,subtilis Q60 為出發(fā)菌，通過基因工程技術提高PNP 的表達量，比較了兩種PNP 的催化效率.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質粒和培養(yǎng)基

肌苷生產菌枯草芽孢桿菌(B.,subtilis)Q60、枯草芽孢桿菌(B.,subtilis)168、大腸桿菌(E.,coli)DH5α和質粒pBE43(大腸桿菌–枯草芽孢桿菌穿梭質粒，含有P43 啟動子)、pBSA43(大腸桿菌–枯草芽孢桿菌穿梭質粒，含有 P43 啟動子和 sacB 基因信號肽)、pWB980 (枯草芽孢桿菌質粒，含有P43 啟動子和sacB 信號肽)均為本實驗室保藏.

活化斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，NaCl 2.5，瓊脂20，pH 7.0～7.2.

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母浸膏15，玉米漿12，NaCl 2.5，尿素2，pH 7.0～7.2.

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖140(單獨滅菌)，玉米漿16，酵母粉15，(NH4)2SO4,22，MgSO4·7H2O,5，KH2PO4,5，CaCO320，pH 7.0～7.2.

1.1.2 試劑及儀器

限制性內切酶 Kpn Ⅰ、Sal Ⅰ和 Xho Ⅰ，F(xiàn)ermentas 公司；Solution Ⅰ、Taq DNA 聚合酶、1,kbp DNA Ladder，大連寶生物工程有限公司；普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒，天津為科生物有限公司；TCA，純度99%，山東陽成生物科技有限公司；其他試劑為國產分析純試劑.

PCR 儀，Bio-Rad 公司；SBA–40C 型生物傳感儀，山東生物科學研究所.DNA 序列分析比較采用DNAMAN 2.0 軟件，引物設計采用Primer Premier 5軟件，電泳圖分析采用Image master Total Lab v1.00軟件.

1.2 實驗方法

1.2.1 過表達PNP 質粒的構建

根據(jù)B.,subtilis 168 的deoD 的基因序列(Gene ID：940038)和pupG 的基因序列(Gene ID：938731)設計引物，見表1.PCR 反應體系：首先94,℃預變性3,min，然后95,℃變性30,s，58,℃退火30,s，72,℃延伸60,s，進行30 輪循環(huán)擴增，最后一個循環(huán)完成后，72,℃繼續(xù)延伸10,min.質粒構建流程：(1)使用引物deoDin-S 和deoD-A 擴增deoD 基因片段，Kpn Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切后連接到載體pBE43，構建deoD 胞內表達質粒pBEdeoD.(2)使用引物pupGin-S 和pupGA 擴增pupG 片段，Kpn Ⅰ和SalⅠ雙酶切后連接到載體pBE43，構建pupG 胞內表達質粒pBEpupG.(3)以質粒pWB980 為模板，引物sacB-S 和sacB-A 擴增sacB 信號肽序列(144,bp)；引物deoD-S 和deoD-A擴增deoD 基因，通過重疊PCR 將sacB 信號肽與deoD 連接，KpnⅠ和SalⅠ雙酶切后連接到載體pBE43，構建分泌表達質粒pBSAdeoD.(4)pupG-S和pupG-A 擴增pupG 片段，XhoⅠ和SalⅠ雙酶切后連接到載體pBSA43，構建分泌表達質粒pBSApupG.所有連接產物轉化大腸桿菌DH5α，提取陽性轉化子質粒進行雙酶切驗證，并送華大基因公司測序.

1.2.2 過表達PNP 重組菌的構建

將4 個重組質粒分別電轉化導入肌苷生產菌B.,subtilis Q60[12]，37,℃培養(yǎng)，次日挑取轉化子，提取質粒，進行雙酶切驗證，正確的分別命名為過表達PNP 菌株Q60/pBEdeoD 和Q60/pBEpupG；分泌過表達PNP 菌株Q60/pBSAdeoD 和Q60/pBSApupG.

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers in this study

1.2.3 重組菌發(fā)酵生產利巴韋林

將4 個重組菌株和只含有空質粒pBE43 的對照菌株進行500,mL 搖瓶發(fā)酵實驗.

活化培養(yǎng)：取斜面保藏菌種劃線接種于活化斜面，32,℃培養(yǎng)12～14,h，轉接后重復1 次.

種子培養(yǎng)：從新鮮活化斜面上挑取兩環(huán)菌體接入種子培養(yǎng)基中，500,mL 三角瓶裝液量為 30,mL，10,μg/mL 卡納霉素抗性，32,℃、200,r/min 振蕩培養(yǎng)8～10,h 至A600＝8～10.

發(fā)酵培養(yǎng)：10%接種量，36,℃、200,r/min 振蕩培養(yǎng)96,h.從發(fā)酵12,h 開始每隔12,h 添加0.2,g TCA，共添加3 次.

1.2.4 分析方法

發(fā)酵過程中每12,h 測定波長600,nm 下的吸光度.采用SBA–40C 型生物傳感儀測定發(fā)酵液中殘?zhí)牵簩l(fā)酵液離心，取上清液，用去離子水稀釋100倍后，取25,μL 稀釋液進樣直接讀數(shù).采用高效液相色譜法測定發(fā)酵液中的利巴韋林和肌苷含量：色譜柱為Kromasil C18 柱(250,mm×416,mm，5,μm).利巴韋林測定條件：發(fā)酵液用離子水稀釋100 倍，流動相為V(乙腈)∶V(水)＝4∶96 的乙腈水溶液，流量1.0,mL/min，柱溫18.5,℃，檢測波長207,nm.肌苷測定條件：發(fā)酵液用1,mol/L NaOH 溶液稀釋10 倍，沸水浴5,min 后離心取上清液，上清液用去離子水稀釋100 倍，流動相為V(乙腈)∶V(水)＝10∶90 的乙腈水溶液，流量 1.0,mL/min，柱溫 25,℃，檢測波長248,nm.

2 結果與分析

2.1 重組質粒和重組菌株的構建及鑒定

胞內過表達質粒pBEdeoD、pBEpupG 和分泌過表達質粒pBSAdeoD、pBSApupG 的酶切驗證結果如圖1 所示.圖1(a)中，pBEdeoD 用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切后在800,bp 左右出現(xiàn)目的條帶.pBEpupG 用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切后在830,bp 左右出現(xiàn)目的條帶，與預期相符.圖1(b)中，pBSAdeoD 用KpnⅠ和SalⅠ雙酶切后在870,bp 左右出現(xiàn)目的條帶，符合sacB 信號肽序列和 deoD 重疊后的片段大小.pBSApupG 用XhoⅠ和SalⅠ雙酶切后在830,bp左右出現(xiàn)目的條帶，與預期相符.重組質粒測序，結果與GenBank 上報道的基因序列一致.

圖1 pBEdeoD、pBEpupG、pBSAdeoD 和pBSApupG 的驗證Fig.1 Identification of the recombined plasmids pBEdeoD，pBEpupG，pBSAdeoD and pBSApupG

2.2 重組菌發(fā)酵合成利巴韋林

為了研究兩種結構的PNP 在肌苷生產菌中過表達以及不同的表達方式對合成利巴韋林的影響，將4株重組菌株和只含有pBE43 空質粒的對照菌進行搖瓶發(fā)酵實驗，定期取樣測定菌體生長吸光度、肌苷和利巴韋林的產量，發(fā)酵過程曲線如圖2 所示.

圖2 利巴韋林搖瓶發(fā)酵過程曲線Fig.2 Fermentation parameters of ribavirin

結果顯示：4 株重組菌的菌體干質量都小于對照菌，胞外分泌過表達重組菌 Q60/pBSAdeoD 和Q60/pBSApupG 減少明顯，而且這兩株菌的對數(shù)期縮短，20,h 后即進入平穩(wěn)期；而胞內表達重組菌Q60/pBEdeoD 和Q60/pBEpupG 與對照菌相似，在40,h 左右才進入平穩(wěn)期.其原因可能是酶的過表達給菌體的生長造成了不同程度的負擔.對照菌從10,h 開始積累肌苷，產量平穩(wěn)上升，發(fā)酵80,h 后趨于平緩.對照菌在添加TCA 后開始有少量的利巴韋林積累，但是積累量保持在2,g/L，不隨著肌苷的增長而上升.4 株重組菌株的肌苷含量與對照菌相比則明顯減少，添加TCA 后，利巴韋林合成量明顯增長，PNP816重組菌Q60/pBEpupG 和Q60/pBSApupG 的增長程度較大.PNP702重組菌 Q60/pBEdeoD 和Q60/pBSAdeoD 的利巴韋林合成趨勢雖然與前者一致，但是合成量低20%左右.另外，相同的PNP 采用分泌過表達利巴韋林合成量比胞內過表達高.

4 株重組菌的利巴韋林產量是對照菌的4～6倍；肌苷剩余量僅為對照菌的15%～30%，說明過表達PNP 可以提高利巴韋林的合成效率.重組菌的利巴韋林產量、肌苷轉化率和TCA 利用率見表2.

表2 重組菌的核苷總產量及轉化率比較Tab.2 Comparison of the yields of total nucleoside and inosine utilization of the recombined strains

由表2 可以看出重組菌Q60/pBEpupG 的利巴韋林產量比Q60/pBEdeoD 高32.5%；Q60/pBSApupG的利巴韋林產量比Q60/pBSAdeoD 高39.6%，說明過表達PNP816更有利于利巴韋林的合成.胞外分泌型過表達重組菌Q60/pBSAdeoD 的產量比Q60/ pBEdeoD 高9.6%；Q60/pBSApupG 比Q60/pBEpupG 高15.5%，4 株重組菌的TCA 利用率也呈現(xiàn)同樣的趨勢，與對照菌相比，分別提高了3.2～5.5 倍，說明PNP 的分泌表達有利于利巴韋林的合成.

3 討論

發(fā)酵法合成利巴韋林需要核苷作為前體物，PNP作為催化劑.研究表明3 種嘌呤核苷中肌苷是最適底物，所以本研究以肌苷生產菌作為出發(fā)菌，構建4株不同類型的PNP 過表達菌株，通過外源添加TCA的方法將利巴韋林的合成和肌苷的發(fā)酵相偶聯(lián)，隨著菌體生長、前體物肌苷的積累和酶的表達，實現(xiàn)一步法合成利巴韋林.

發(fā)酵結果顯示，在肌苷生產菌中過表達PNP816利巴韋林的合成效率和底物TCA 的利用率都高于PNP702，這與已發(fā)表的研究結果一致.Xie 等[9]發(fā)現(xiàn)當以肌苷作為反應底物時，PNP702和PNP816的酶促動力學參數(shù)Km值分別為(1.23±0.01),μmol/L 和(0.31±0.01),μmol/L，PNP816具有更強的親和力，所以利巴韋林產量更高.另外三聚體酶蛋白每形成1 個具有催化活性的酶分子需要3 條肽鏈；而六聚體酶蛋白每形成1 個具有催化活性的酶分子需要6 條肽鏈，當利用同樣的表達質粒，在同樣的發(fā)酵條件下，相同時間的轉錄量相近，三聚體形成具有催化活性的酶分子所需要的能量少于六聚體，效率更高[10].

利巴韋林的合成過程中外源添加的底物TCA 存在于發(fā)酵液中，將PNP 分泌到胞外可能會提高反應效率，實驗結果也顯示分泌過表達重組菌的利巴韋林產量和TCA 的利用率都高于胞內表達的重組菌，但是肌苷的利用率并沒有胞內表達高.利巴韋林是核苷類似物，含有1 分子5–磷酸核糖，從兩種核苷類產物的總量上看，分泌表達比胞內表達積累的核苷總量更高，可能原因是底物肌苷直接與TCA 在胞外進行反應，減少了TCA 跨膜輸入和利巴韋林跨膜輸出的消耗，菌株的負擔更小.轉化率低的可能性是酶的表達方式不同，導致酶量和活性方面存在差異；另外，胞內和胞外的催化環(huán)境不同，酶的催化活性也可能受到了影響[11].

研究表明[12]：當催化以肌苷為底物反應時的催化活性設定為酶活標準(100%)時，PNP702催化鳥苷的活性為46.2%；PNP816催化鳥苷的活性為87.7%；等質量的純化重組PNP 在磷酸鹽緩沖液中以鳥苷為核糖基供體時兩種酶的利巴韋林終產率均略高于肌苷.理論上鳥苷的分解產物鳥嘌呤較肌苷的分解產物次黃嘌呤溶解性低，有利于反應向利巴韋林合成方向進行[13]；但是目前還未見通過改造鳥苷生產菌提高PNP 活性來研究利巴韋林合成的相關報道.因此，今后的研究方向可以考慮以鳥苷作為核苷前體物，對鳥苷高產菌進行改造，提高其PNP 的酶活性，研究對利巴韋林合成的影響.

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